高效液相色譜-03

第七章

液相色譜分析法一、液相色譜固定相stationaryphaseofHPLC二、液相色譜流動相

mobilephaseofHPLC第三節(jié)

液相色譜的固定相與流動相highperformanceliquidchromatographstationaryphaseandmobilephaseofHPLC2023/2/5一、液相色譜固定相

stationaryphasesofLC（一）.液-液分配及離子對分離固定相（1）全多孔型擔(dān)體

由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；（2）表面多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；2023/2/5（3）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應(yīng)用最廣；

c.硅碳鍵型：≡Si—C

d.硅氮鍵型：≡Si—N2023/2/5用化學(xué)反應(yīng)的方法將固定液的官能團鍵合在載體(硅膠)表面上，所形成的固定相，稱為化學(xué)鍵合相。具有分配和吸附作用。優(yōu)點：①使用過程不易流失；②化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在pH2~8的溶液不變質(zhì)；③熱穩(wěn)定性好，一般在70℃以下穩(wěn)定；④載樣量大，比硅膠高約一個數(shù)量級；⑤適于作梯度洗脫?；瘜W(xué)鍵合相2023/2/5化學(xué)鍵合相一般用硅膠作載體，具有分配作用和一定的吸附作用。吸附作用的大小視鍵合覆蓋率而定。用化學(xué)反應(yīng)方法將載體表面上殘存的硅醇基除去，稱為封尾(封頂或遮蓋)，所形成的鍵合相稱為封尾鍵合相，完全封尾的鍵合相無吸附作用，缺點是疏水強。按極性分類：非極性、中等極性、極性鍵合相3類化學(xué)鍵合相2023/2/5化學(xué)鍵合相1.非極性鍵合相：十八烷基硅烷鍵合相(ODS)是最常用的非極性鍵合相。2.中等極性鍵合相：常見的有醚基鍵合相。3.極性鍵合相：強極性－氨基鍵合相(分析糖類)；中強極性－氰基鍵合相。2023/2/5（二）.液-固吸附分離固定相

種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；

2023/2/51.硅膠

⑴無定形多孔硅膠，國產(chǎn)代號YWG，dp5~10μm⑵球形全多孔硅膠，國產(chǎn)代號YQG，dp3~10μm⑶堆積硅珠，國產(chǎn)代號YQG，dp3~5μm2.氧化鋁⑴球形(5～10μm)；⑵無定形(5～10μm)。3.高分子微孔多球(有機膠)

⑴國產(chǎn)YSG系列；⑵日立3010膠等。4.其它

⑴分子篩；⑵聚酰胺等。液－固色譜固定相2023/2/5（三）.離子交換色譜分離固定相結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團）

樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）2023/2/5（四）.空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠；非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶颍哂泻愣讖胶驼６确植肌?023/2/5(五)色譜柱-結(jié)構(gòu)色譜柱是實現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。色譜填料：經(jīng)過制備處理后，用于填充色譜柱的物質(zhì)顆粒，通常是5-10粒徑的球形顆粒。色譜柱管：內(nèi)部拋光的不銹鋼管。典型的液相色譜分析柱尺寸是內(nèi)徑4.6mm，長250mm。色譜柱：也稱固定相，是將色譜填料填充到色譜柱管中所構(gòu)成的,其結(jié)構(gòu)如圖所示。2023/2/5(五)色譜柱-色譜柱裝填干法填充：在硬臺面上鋪上軟墊，將空柱管上端打開垂直放在軟墊上，用漏斗每次灌入50-100mg填料，然后垂直臺面墩10-20次。濕法填充：又稱淤漿填充法，使用專門的填充裝置（圖8-9）。2023/2/5(五)色譜柱-使用和維護 色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。 ①避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。

②一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則 反沖會迅速降低柱效。 ③選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。 ④避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進行預(yù)處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。

⑤保存色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。 ⑥色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M行清洗；另一種可能是大分子進入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。2023/2/5(五)色譜柱-填料的結(jié)構(gòu)色譜填料是由基質(zhì)和功能層兩部分構(gòu)成?；|(zhì)：又常稱作載體或擔(dān)體，通常制備成數(shù)微米至數(shù)十微米粒徑的球形顆粒，它具有一定的剛性，能承受一定的壓力，對分離不起明顯的作用，只是作為功能基團的載體。常用來作基質(zhì)的有硅膠和有機高分子聚合物微球。功能層：是通過化學(xué)或物理的方法固定在基質(zhì)表面的、對樣品分子的保留起實質(zhì)作用的有機分子或功能團。如圖8-10是硅膠基質(zhì)的冠醚大分子固定相的結(jié)構(gòu)示意圖，功能層冠醚分子吸附或鍵合在硅膠基質(zhì)的表面。2023/2/5(五)色譜柱-填料的結(jié)構(gòu)4.26填料的物理結(jié)構(gòu)：分為微孔型（或凝膠型）、大孔型（全多孔型）、薄殼型和表面多孔型四種類型，如圖8-11所示。2023/2/5二、液相色譜的流動相

mobilephasesofLC1.流動相特性

（1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。2023/2/52.流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。2023/2/53.流動相的選擇

①樣品易溶，且溶解度盡可能大。②化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱子。③不妨礙檢測器檢測，紫外波長處無吸收。④粘度低，流動性好。⑤易于從其中回收樣品。⑥無毒或低毒，易于操作。⑦易于制成高純度，即色譜純。⑧廢液易處理，不污染環(huán)境。2023/2/53.流動相選擇

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)2023/2/54.選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。2023/2/55分離方程式依據(jù)分離方程式討論溶劑系統(tǒng)對分離度的影響分離度受三項因素左右：a項由色譜柱的質(zhì)量決定；b、c兩項由流動相決定。相對保留值r與容量因子k雖然相互關(guān)聯(lián)，但溶劑的種類主要改變r。這是因為溶劑的種類不同，分子間的作用力的性質(zhì)、強度不同，選擇性不同。在溶劑種類確定以后，配比的調(diào)整只是改變極性，改變洗脫能力，改變保留時間，而分子間作用力的性質(zhì)不變，因此主要是改變?nèi)萘恳蜃觡。概括為：溶劑種類主要影響相對保留值r(主要改變峰間距)，溶劑配比主要影響容量因子k(主要改變保留時間)。2023/2/5組分的分配系數(shù)，由樣品組分、溶劑、固定相三者間的作用力(分子間作用力)綜合作用所決定(表7-2)Snyder選用了乙醇、二氧六環(huán)、硝基甲苯3個參考物，用于檢驗3種分子間作用力，分別用Xe、Xd、Xn表述。測定、計算出溶劑的極性參數(shù)P′值列于表7－3。P′值大者，極性大，洗脫能力大。表7-2參考物與被檢溶劑的作用力關(guān)系參考物乙醇(質(zhì)子給予體)二氧六環(huán)(質(zhì)子受體)硝基甲烷(強偶極)被檢溶劑的作用力類型質(zhì)子受體作用力(Xe)質(zhì)子給予作用力(Xd)強偶極作用力(Xn)6Snyder溶劑分類2023/2/5表7-3常用溶劑的極性參數(shù)與分子間作用力溶劑

P′XeXdXn苯2.70.230.320.45乙醚2.80.530.130.34二氯甲烷3.10.290.180.53正丙烷4.00.530.210.26四氫呋喃4.00.380.200.42氯仿4.10.250.410.33乙醇4.30.520.190.29乙酸乙酯4.40.340.230.43丙酮5.10.350.230.42甲醇5.10.480.220.31乙腈5.80.310.270.42乙酸6.00.390.310.30水10.20.370.370.252023/2/51.正相洗脫用極性小于固定相的流動相的洗脫方式，稱為正相洗脫、正相展開。適用于正相色譜法。例如，水、正己烷、正戊烷的值分別為10.2、0.1、0.0，作正相洗脫時，水洗脫能力最強，正己烷和正戊烷的洗脫能力最弱。2.反相洗脫與正相洗脫相反6正相洗脫與反相洗脫2023/2/51.等度洗脫(isocraticelution)用恒定配比的溶劑系統(tǒng)的洗脫方式，稱為等度洗脫優(yōu)點：簡便、重復(fù)性好、色譜柱易再生。缺點：對于成分復(fù)雜的樣品，效果欠佳。2.梯度洗脫(gradientelution)梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、pH值、離子強度相應(yīng)地變化，達到提高分離效果、縮短分析時間的目的。7洗脫方式2023/2/57洗脫方式梯度洗脫的實質(zhì)：是通過不斷地變化流動相的濃度配比，來調(diào)整混合樣品中各組分的K值，使所有譜帶都以最佳平均K值通過色譜柱。比較梯度洗脫與程序升溫：在梯度洗脫中溶質(zhì)K值的變化是通過溶劑的極性、pH值和離子強度來實現(xiàn)的，用于分離組分性質(zhì)差別較大的復(fù)雜樣品；而程序升溫是借改變溫度來影響溶質(zhì)的K值，用于分離寬沸程的混合樣品。優(yōu)點：①縮短分析周期；②提高分離效果；③改善峰形，很少拖尾；④增加檢測靈敏度。2023/2/5高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。流動相溶劑的選擇將直接影響組分的分離度.1.基本要求⑴溶劑必須具有合適的極性和良好的選擇性(相對于待測樣品)，參閱Snyder溶劑分類；⑵溶劑要與檢測器匹配，對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測波長比溶劑的紫外截止波長要長；溶劑名稱紫外截止波長/nm正己烷190二硫化碳380四氯化碳265苯210氯仿245二氯甲烷233四氫呋喃212丙酮330乙腈190甲醇205水1878流動相溶劑的選擇2023/2/58流動相溶劑的選擇⑶高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加50～100nm。⑷化學(xué)穩(wěn)定性好。不與樣品