菊花組織培養(yǎng)

課題一菊花的組織培養(yǎng)學習目標：掌握植物細胞的全能性，明確植物細胞體現(xiàn)全能性的條件。了解植物組織培養(yǎng)技術在生產(chǎn)中的應用。熟悉植物組織培養(yǎng)的基本過程。了解影響植物組織培養(yǎng)的各種因素。掌握植物組織培養(yǎng)的基本技術。有絲分裂受精卵細胞分化

在個體發(fā)育中，由一個或一種細胞增殖產(chǎn)生的后代，在形態(tài)、結構和生理功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異的過程。1、細胞分化的概念一、知識回顧黑色素細胞在體外培養(yǎng)30多代后仍能合成黑色素；離體培養(yǎng)的上皮細胞，始終保持為上皮細胞，而不會變成其他類型的細胞。2、穩(wěn)定性3、不可逆性細胞分化發(fā)生在整個生命進程中。1、持久性2、細胞分化的特點造血干細胞原紅細胞早幼紅細胞中幼紅細胞晚幼紅細胞成熟紅細胞死亡4、普遍性

細胞分化是否意味著細胞中遺傳物質(zhì)的改變？

遺傳物質(zhì)沒有改變，不同組織的細胞共同來源于受精卵，經(jīng)有絲分裂產(chǎn)生。3、細胞分化的實質(zhì)ABDCEEDCABEDCABEDCABEDCAB基因在個體發(fā)育過程中，不同細胞中遺傳信息的執(zhí)行情況不同即基因的選擇性表達的過程

紅細胞合成血紅蛋白

(不合成肌動蛋白)肌細胞肌動蛋白基因開啟合成肌動蛋白

(不合成血紅蛋白)肌動蛋白基因關閉血紅蛋白基因關閉血紅蛋白基因開啟試一試:現(xiàn)在你能解釋這些現(xiàn)象了嗎?4、細胞分化的結果

細胞產(chǎn)生了不同種類的蛋白質(zhì)即出現(xiàn)了不同的結構和功能愈傷組織胚狀體1958，美國，斯圖爾德

植物組織培養(yǎng)離體二、基礎知識（一）植物組織培養(yǎng)概念關鍵詞：外植體、脫分化、再分化、愈傷組織在無菌和人工控制條件下，將離體的植物（）

培養(yǎng)在人工配置的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導其脫分化產(chǎn)生愈傷組織再分化形成叢芽，最終形成

。又稱：植物離體培養(yǎng)器官、組織、細胞完整的植株

由高度分化的植物組織或細胞產(chǎn)生愈傷組織的過程。

：脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進行培養(yǎng)，又可以重新分化成根或芽等器官的過程。

：用于離體培養(yǎng)的植物器官或組織片段。

：細胞排列疏松、無規(guī)則、高度液泡化的無定形的薄壁細胞。外植體脫分化（或去分化）：再分化愈傷組織切取形成層無菌接種誘導愈傷組織的形成試管苗的形成培養(yǎng)室移栽脫分化再分化（二）植物組織培養(yǎng)的基本過程植物組織培養(yǎng)過程離體組織或細胞植物體脫分化細胞分裂素≈生長素愈傷組織芽根細胞分裂素>生長素細胞分裂素<生長素再分化植物細胞培養(yǎng)不需要光需要光（三）植物組織培養(yǎng)的理論基礎---細胞全能性概念：高度分化的植物細胞，仍然具有發(fā)育成完整個體的潛能?；A：生物體的每一個細胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)。表達條件：離體條件無菌操作適宜物質(zhì)的誘導和調(diào)節(jié)（植物激素）適宜的營養(yǎng)物質(zhì)溫度、酸堿度、光照等條件的控制思考這個試驗說明了已經(jīng)分化的細胞核具有什么特性？高度分化的動物體細胞的細胞核有發(fā)育成完整個體的潛能對比：多利羊的誕生動物細胞有沒有這種能力？已經(jīng)分化的細胞（核），仍然具有發(fā)育成完整個體的潛能。細胞全能性思考為什么已經(jīng)分化的細胞具有全能性呢？高度分化的細胞含有保持物種發(fā)育所需要的全套基因植物組織培養(yǎng)技術動物的克隆技術1、培育無病毒植株2、大規(guī)模培養(yǎng)愈傷組織（提取紫草素，治療燙傷和割傷的藥物以及染料和化妝品的原料）4、基因工程中亦需用到植物組織培養(yǎng)的方法（受體細胞為植物細胞）（四)植物組織培養(yǎng)的應用：

3、人工種子（解決有些作物品種繁殖能力差，結子困難或發(fā)芽率低等問題）人工種子三、影響植物組織培養(yǎng)的因素1、材料的種類、年齡及保存時間長短等2、營養(yǎng)3、植物激素4、PH、溫度、光照等條件1、植物材料的選擇

---直接關系實驗的成敗

①不同植物的組織培養(yǎng)難度不同eg：煙草和胡蘿卜的組織培養(yǎng)較為容易

枸杞愈傷組織的芽誘導比較難菊花的組織培養(yǎng)一般選擇未開花植株的莖上部新萌生的側枝②同一種植物材料，材料的年齡、保存時間的長短等也會影響實驗結果。

2、營養(yǎng)---MS培養(yǎng)基A、大量元素（）

B、微量元素（）C、有機物：()D、植物激素：()赤霉素等

Ｎ、Ｐ主要影響蛋白質(zhì)、核酸的合成；

K、Ca、Mg、S主要影響酶的活性。無機鹽蔗糖既是碳源也是調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)；維生素能促進細胞分裂和誘導器官分化；甘氨酸是蛋白質(zhì)的組成成分，也是有機氮源。N、P、K、Ca、Mg、SB、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖生長素、細胞分裂素、MS固體培養(yǎng)基成分及比例討論：你能說出各種營養(yǎng)物質(zhì)的作用嗎？同專題2中微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？答：微量元素和大量元素提供植物細胞生活所必需的無機鹽；蔗糖提供碳源，同時能夠維持細胞的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營養(yǎng)需求。微生物培養(yǎng)基以有機營養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機營養(yǎng)，無機鹽混合物包括植物生長必須的大量元素和微量元素兩大類。常用植物激素：生長素、細胞分裂素和赤霉素

生長素、細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關鍵性激素在生長素存在的情況下，細胞分裂素的作用呈加強的趨勢激素的使用順序、使用的量及比例影響植物細胞的發(fā)育方向3、植物激素的影響生長素類：2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。細胞分裂素類：激動素（KT）、6－芐基嘌呤（6－BA）、玉米素（ZT）等。赤霉素類：赤霉酸（GA3）等作用：2，4－D有利于愈傷組織的生長；

IAA、NAA、IBA有利于器官分化。作用：促進細胞的分裂與分化，其中KT能明顯促進芽的分化而抑制根的形成。作用：促進不定芽和幼株伸長。使用順序實驗結果先使用生長素，后使用細胞分裂素有利于細胞分裂，但不利分化先使用細胞分裂素后使用生長素細胞既分裂、也分化同時使用分化頻率高使用比例實驗結果生長素細胞分裂素>生長素細胞分裂素<生長素細胞分裂素＝有利于根的分化有利于芽的分化，抑制根的分化促進愈傷組織生長激素的使用順序、使用量及比例影響植物細胞的發(fā)育方向：植物組織培養(yǎng)過程離體組織或細胞植物體脫分化細胞分裂素≈生長素愈傷組織芽根細胞分裂素>生長素細胞分裂素<生長素再分化植物細胞培養(yǎng)不需要光需要光需光否abABC補充下圖（注：a、b過程，A、B、C為激素使用比例）a過程分裂方式（）b過程分裂方式（）有絲分裂有絲分裂思考：以下培養(yǎng)基出現(xiàn)的現(xiàn)象反應了什么問題？生長素/細胞分裂素高利于根的形成適中利于愈傷組織的形成供參考的配方1、誘導菊花愈傷組織：在MS培養(yǎng)基中加入BA和NAA，質(zhì)量濃度均為0.5mg／Ｌ２、誘導菊花從芽：在MS培養(yǎng)基中加入BA和NAA，質(zhì)量濃度分別為2---3mg／Ｌ和0.02—0.03mg／Ｌ3、誘導菊花生根：在MS培養(yǎng)基各成分用量減半，并添加入NAA或IAA，質(zhì)量濃度均為0.1mg／Ｌ4．溫度、光照、pH的影響光照：菊花每日用日光燈照射12h。溫度：

大多數(shù)植物組織培養(yǎng)控制在23～27℃，低于15℃時植物組織會表現(xiàn)生長停止；高于35℃時對植物生長不利。菊花的組織培養(yǎng)控制在18～22℃。pH：

不同植物對培養(yǎng)基最適pH的要求不同，大多數(shù)控制在5～6.5。

菊花的組織培養(yǎng)控制在5.8左右。制備MS固體培養(yǎng)基外植體消毒接種培養(yǎng)栽培四、實驗操作移栽沖洗—酒精—無菌水沖洗—氯化汞—無菌水沖洗至少三次之上配制各種母液配制培養(yǎng)基滅菌（一）制備MS固體培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基包括20多種營養(yǎng)成分，實驗室一般使用4℃保存配制好的培養(yǎng)基母液來制備1、配制各種母液①無機物中大量元素濃縮10倍，微量元素濃縮100倍，常溫保存②激素類、維生素類以及用量較小的有機物一般可按1mg/ml的質(zhì)量濃度單獨配制成母液③用母液配制培養(yǎng)基時，需要根據(jù)各種母液的濃縮倍數(shù)，計算用量2、配制培養(yǎng)基分裝到錐形瓶中，每瓶分裝50ml或100ml①（）②（）③（）

由于菊花的莖段的組織培養(yǎng)比較容易，因此不必添加植物激素3、滅菌分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進行高壓蒸汽滅菌配制培養(yǎng)液調(diào)PH培養(yǎng)基的分裝在植物組織培養(yǎng)的過程中，為什么要進行一系列的消毒、滅菌，并且要求無菌操作？1、植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料體積小、抗性差，對培養(yǎng)條件的要求較高：2、用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基同樣適合于某些微生物的生長,微生物產(chǎn)生的代謝廢物會毒害培養(yǎng)的對象；培養(yǎng)物一旦受到微生物的污染，就會導致實驗前功盡棄；因此要進行嚴格的無菌操作。無菌操作的原因？1、選材：

（二）外植體消毒2、消毒①流水沖洗菊花莖段用流水沖洗后可少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在

下沖洗20min左右②酒精處理用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入

中搖動2－3次，持續(xù)6－7s，立即將外植體取出，在無菌水中清洗③消毒液處理取出后用

吸干外植體表面的水分，放入

中1－2min，取出后在無菌水中至少清洗3次，漂凈消毒液流水菊花莖段，取生長旺盛的嫩枝體積分數(shù)為70％的酒精質(zhì)量分數(shù)為0.1％的氯化汞溶液無菌吸水紙（三）接種1、接種前用體積分數(shù)70%酒精擦拭工作臺，點燃酒精燈，所有操作在酒精燈旁邊進行，每次使用器械后都要灼燒滅菌2、將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶整齊的排列在酒精燈左側，將消過毒的菊花莖段在無菌培養(yǎng)皿中切成小段（0.5-1cm）3、左手持錐形瓶，右手拉開捆扎錐形瓶的繩子，并將封口膜攥于右手手心，以避免封口膜接觸瓶口的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋轉通過火焰。4、右手用鑷子夾取菊花莖段，插入培養(yǎng)基中，不要倒插，每瓶6-8塊外植體，接種后，將封口膜重新扎好。5、接種注意事項①每接種一塊外植體前，鑷子需放入體積分數(shù)為70％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精燈火焰上燒一遍，冷卻后再接種②外植體在培養(yǎng)基中要分布均勻，放置外植體數(shù)量根據(jù)錐形瓶的大小確定，一般胡蘿卜3－4塊，菊的莖或葉6－8塊，也不要太少，以充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和光照條件③插入時應注意方向：（）不要倒插。莖段、莖尖基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分形態(tài)學上端朝上，形態(tài)學下端朝下思考：你打算做幾組重復？你打算設置對照實驗嗎？答：每種材料或配方至少要做一組以上的重復。設置對照實驗可以取用一個經(jīng)過滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說明培養(yǎng)基制作合格，沒有被雜菌污染。（四）培養(yǎng)接種后的錐形瓶最好放在無菌箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)期間應定期消毒培養(yǎng)溫度控制在18-22℃每日用日光燈光照12h正常苗污染苗1、外植體帶菌2、培養(yǎng)基及接種器具滅菌不徹底3、接種操作時帶入4、環(huán)境不清潔污染途徑（五）移栽移栽生根的菊花試管苗之前，應先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日。一般放置在20～25℃的遮蔭環(huán)境中，適應5～7d。試管苗不萎蔫，有新生長的趨勢，便可移栽。1、打開封口膜2、清洗轉移用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時間3、移栽幼苗長壯后，移栽到土壤中固體基質(zhì)型，含水量高、蓄水性強、透性好，適合栽培珍珠巖

,珍珠巖是一種火山噴發(fā)的酸性熔巖，經(jīng)急劇冷卻而成的玻璃質(zhì)巖石，有弧形或圓形裂隙，如珍珠的結構，所以被命名為珍珠巖。蛭石是一種天然、無毒的礦物質(zhì)，在高溫作用下會膨脹的礦物。它是一種比較少見的礦物，屬于硅酸鹽。（六）栽培幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花1、培養(yǎng)基的滅菌（高壓蒸汽滅菌）2、外植體的消毒（酒精、氯化汞）3、接種的無菌操作（酒精、酒精燈——灼燒）4、無菌箱中的培養(yǎng)；5、移栽到消過毒的環(huán)境中生存一段時間。小組討論：在整個操作過程中，是如何來實現(xiàn)無菌環(huán)境的？結果分析與評價（一）對接種操作中污染情況的分析（二）是否完成了對植物組織的脫分化和再分化（三）是否進行了統(tǒng)計、對照與記錄（四）生根苗的移栽是否合格五、課題延伸1、一般來說，容易進行無性繁殖的植物，也容易進行組織培養(yǎng)2、實例：蘆薈、豆瓣綠、秋海棠、月季營養(yǎng)繁殖扦插嫁接壓條

扦插嫁接壓條

探究植物激素的使用比例（A=生長素/細胞分裂素）對植物組織培養(yǎng)的影響

例如：設計對照實驗

（1）不加植物激素（2）A＝1

（3）A＞1

（4）A＜1菊花的組織培養(yǎng)再分化材料性質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)物質(zhì)、環(huán)境條件外植體的消毒接種基本原理:細胞的全能性基本過程:脫分化愈傷組織影響因素：操作流程：配制MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)移栽栽培練習1.答：植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料體積小、抗性差，對培養(yǎng)條件的要求較高。用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基同樣適合于某些微生物的生長，如一些細菌、真菌等的生長。而培養(yǎng)物一旦受到微生物的污染，就會導致實驗前功盡棄，因此要進行嚴格的無菌操作。2.答：外植體的生理狀態(tài)是成功進行組織培養(yǎng)的重要條件之一。生長旺盛的嫩枝生理狀況好，容易誘導脫分化和再分化。達標檢測1．下列四個選項中，肯定沒有采用植物組織培養(yǎng)技術的一項是（）

A．花藥離體培養(yǎng)得到單倍體植株

B．秋水仙素處理萌發(fā)的種子或幼苗得到多倍體植株

C．基因工程培育的抗棉鈴蟲的棉花植株

D．細胞工程培育“番茄－馬鈴薯”雜種植株基礎鞏固2．菊花的花粉經(jīng)組織培養(yǎng)可發(fā)育成一株幼苗，這一過程不涉及下列哪一項（）A．有絲分裂、細胞分化、組織器官的形成B．呼吸作用、光合作用、相關激素的調(diào)控C．DNA的復制、轉