生化工藝第三章培養(yǎng)基的選擇與滅菌1

生物化工工藝學(xué)

第三章培養(yǎng)基的選擇與滅菌任課教師：陳磊祥谷氨酸和味精生產(chǎn)工藝的培養(yǎng)基淀粉水解后的糖化液玉米漿糖蜜無(wú)機(jī)鹽其它培養(yǎng)基的定義提供微生物生長(zhǎng)繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。一、概述

葡萄糖或乳糖總量的10%玉米漿4%-5%苯乙酸0.5%-0.8%豬油或植物油（消泡劑）0.5%PH值、K、Fe、Mn、Zn、Cu等，其余水生產(chǎn)青霉素工藝培養(yǎng)基從上面例子可看出，發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分包括碳源如葡萄糖、淀粉；氮源如硫酸銨、玉米漿；無(wú)機(jī)鹽和微量元素；前體和誘導(dǎo)物等。一個(gè)良好的培養(yǎng)基配方組成是經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的研究并經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的生產(chǎn)實(shí)踐之后確認(rèn)的，但并不是一成不變的，它也要隨著生產(chǎn)菌種的不斷改良、發(fā)酵工藝條件的不斷改進(jìn)以及發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)的不同而不斷地改進(jìn)、調(diào)整、趨于完善，以達(dá)到充分發(fā)揮菌種最大的生產(chǎn)潛力。

補(bǔ)充1：微生物細(xì)胞的化學(xué)組成及胞外代謝產(chǎn)物

1、微生物細(xì)胞的化學(xué)組成微生物成分細(xì)菌（%）酵母菌（%）霉菌（%）水分75-8570-8085-90蛋白質(zhì)50-80（干重）72-7514-15碳水化合物12-2827-637-40脂肪5-202-154-40核酸10-206-81無(wú)機(jī)元素2-303.8-76-12由表可知，微物細(xì)胞含有80%左右的水分和20%左右的干物質(zhì)，它主要是由C、H、O和N等元素組成，約占全部干物質(zhì)的90%至97%，此外還含有各種無(wú)機(jī)礦物質(zhì)，依次為：PKMgCaSNa及微量元素。

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的確定，主要依據(jù)細(xì)胞的化學(xué)組成及所代謝物的化學(xué)組成。因此，分析微生物細(xì)胞的化學(xué)組成是了解微生物營(yíng)養(yǎng)的基礎(chǔ)。2、微生物胞外代謝產(chǎn)物

微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中，除利用外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成新的細(xì)胞外，還會(huì)產(chǎn)生一些有機(jī)化合物分泌到微生物的體外，這些胞外代謝產(chǎn)物的種類繁多，且因微生物的種類而異。因此，了解這些代謝產(chǎn)物的化學(xué)組成，極有助于微生物培養(yǎng)時(shí)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的選擇和代謝產(chǎn)物的積累。一般來(lái)說(shuō)，微生物的胞外代謝產(chǎn)物的主要包括下面四個(gè)部分。1）代謝副產(chǎn)物

這類產(chǎn)物主要是指伴隨微生物細(xì)胞正常代謝作用所產(chǎn)生的一些小分子化合物。如：CO2、H2、CH4等氣體和乙醇、丙酮、丁醇、丙酸、乳酸等低分子量的醇類、脂肪酸類和酮類，其中許多物質(zhì)是重要的化工原料。

產(chǎn)物名稱用途主要生產(chǎn)菌甲烷能源奧式甲烷桿菌乙醇、異丙醇醫(yī)藥、化工原料、飲料等酵母菌異丙醇、丙酮、丁醇防凍劑、火膠溶劑、樹(shù)膠等丁酸梭菌丙酮、丁醇、甘油重要的有機(jī)溶劑丙酮丁醇梭菌甘油、甘露醇溶劑、潤(rùn)滑劑、化妝品、硝化甘油炸藥醇母菌甘露醇、乙酸合成樹(shù)脂、增韌劑等曲霉菌乙酸食醋、化工原料產(chǎn)醋酸桿菌草酸印染、漂洗皮革、制造塑料和染料曲霉菌和青霉菌乳酸食品乳酸醫(yī)藥和化工原料乳酸菌2）中間代謝產(chǎn)物

指細(xì)胞在代謝途徑中產(chǎn)生的用于合成蛋白質(zhì)、核酸、類脂和多糖等細(xì)胞物質(zhì)的一些小分子物質(zhì)。如氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸和單糖的衍生物。中間代謝產(chǎn)物一般不分泌到微生物體外，而只有當(dāng)微生物細(xì)胞生物合成受阻或外源碳源濃度較高的情況下，才會(huì)有大量的積累和外流。不少中間代謝產(chǎn)物也是重要的食品和化工原料。

產(chǎn)物名稱用途主要產(chǎn)生菌延胡索酸抗氧劑、合成樹(shù)脂、染料黑根霉琥珀酸制漆、染料根霉菌蘋(píng)果酸食品黑曲霉檸檬酸飲料、化工原料黑曲霉核黃素醫(yī)藥棉病囊霉谷氨酸味精谷氨酸棒桿菌肌苷酸調(diào)味品產(chǎn)氨短桿菌3）次級(jí)代謝產(chǎn)物

這類代謝產(chǎn)物是指由微生物細(xì)胞合成的，分子比較復(fù)雜的一些化合物，它既不參與細(xì)胞的組成，又不是酶的活性基團(tuán)，也不是細(xì)胞的儲(chǔ)存物質(zhì)，它們中的大多數(shù)分泌于微生物的體外。

如抗生素、毒素、激素和色素等幾類

4）

胞外水解酶類

許多微生物可產(chǎn)生胞外水解酶類。這類水解酶包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果膠酶、纖維素酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖異構(gòu)酶等?？捎糜谑称?、釀造、紡織、制革、醫(yī)藥和生化試劑等各個(gè)領(lǐng)域。初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物包括哪些物質(zhì)？問(wèn)題補(bǔ)充2：微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)類型

微生物四大營(yíng)養(yǎng)類型

光能自養(yǎng)型光能異養(yǎng)型化能自養(yǎng)型化能異養(yǎng)型微生物六大營(yíng)養(yǎng)要素碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、水專性好氣微生物。這類微生物只能在有空氣或有氧的條件下才能生長(zhǎng)，包括了全部的霉菌、大部分的放線菌及部分的細(xì)菌。專性厭氣微生物。這類微生物只能在沒(méi)有空氣或無(wú)氧的條件下才能生長(zhǎng)，包括了部分細(xì)菌、放線菌。兼性微生物。這類微生物既生物既在空氣或有氧的條件下生長(zhǎng)，又能在沒(méi)有空氣或無(wú)氧的條件下生長(zhǎng)，包括了酵母菌及部分細(xì)菌。問(wèn)題3根據(jù)微生物對(duì)氧的要求，微生物可分為哪幾類？二、培養(yǎng)基的成分重點(diǎn)內(nèi)容生產(chǎn)青霉素工藝培養(yǎng)基從微生物的營(yíng)養(yǎng)要求來(lái)看，所有的微生物都需要水、能源、碳源、無(wú)機(jī)元素及生長(zhǎng)輔助物質(zhì)，如果是好氧微生物則還需要氧氣。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上配制含有純化合物的培養(yǎng)基是相當(dāng)簡(jiǎn)單的，雖然它能滿足微生物的生長(zhǎng)要求，但在大規(guī)模生產(chǎn)上往往是不適合的。

葡萄糖或乳糖總量的10%玉米漿4%-5%苯乙酸0.5%-0.8%豬油或植物油（消泡劑）0.5%PH值、K、Fe、Mn、Zn、Cu等，其余水在發(fā)酵工業(yè)中，必須使用廉價(jià)的原料來(lái)配制培養(yǎng)基，盡可能地滿足下列條件：每克消耗的底物將產(chǎn)生最大的菌體得率或產(chǎn)物得率；能產(chǎn)生最高的產(chǎn)品或菌體的濃度；能得到產(chǎn)物形成的最大速率；副產(chǎn)品的得率最?。粌r(jià)廉并具有穩(wěn)定的質(zhì)量；來(lái)源豐富且供應(yīng)充足；在通氣和攪拌、提取、純化、廢物處理及生產(chǎn)工藝過(guò)程都比較容易。1、工業(yè)上經(jīng)常使用的碳源

在微生物發(fā)酵過(guò)程中，普遍以碳水化合物（各種糖類）、脂肪、有機(jī)酸和醇、碳?xì)浠衔锏茸鳛樘荚?。使用最廣的碳水化合物是玉米淀粉，也可使用來(lái)自其他谷物、馬鈴薯、木薯的淀粉。淀粉可用稀酸和酶快速水解產(chǎn)生不同的葡萄糖制備物。表3-2微生物發(fā)酵生產(chǎn)中使用的糖類

霉菌和放線菌還可以用油脂作碳源。一般地說(shuō)，在培養(yǎng)基中糖類缺乏或發(fā)酵至某一階段，菌體可以利用油脂。常見(jiàn)的油脂主要指動(dòng)、植物油，如豆油、玉米油、棉子油和豬油等。在發(fā)酵過(guò)程中加入的油脂起消沫和補(bǔ)充碳源的雙重作用。菌體利用油脂作碳源時(shí)耗氧量增加，因此必須充分地供氧，否則易導(dǎo)致有機(jī)酸積累，發(fā)酵液的pH值降低。油脂在貯藏過(guò)程中易酸敗，同時(shí)還可能增加過(guò)氧化物的含量，對(duì)微生物的代謝有毒副作用。使用時(shí)注意將油脂貯藏在低溫條件下，貯藏時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。問(wèn)：發(fā)酵過(guò)程中加入的油脂起有何作用？使用時(shí)應(yīng)注意什么？填表：生產(chǎn)菌最優(yōu)先C源嗜甲烷棒狀桿菌乳糖發(fā)酵短桿菌3790青霉素發(fā)酵抗生素和甾類轉(zhuǎn)化的發(fā)酵維生素C發(fā)酵2、工業(yè)上經(jīng)常使用的氮源

工業(yè)生產(chǎn)上所用的微生物都能利用無(wú)機(jī)或有機(jī)氮源，無(wú)機(jī)氮源包括了氮?dú)?、銨鹽或硝酸鹽等。有機(jī)氮源包括了玉米漿、豆餅粉、花生餅粉、棉籽粉、酒精干燥可溶物、酪蛋白水解液、屠場(chǎng)廢物、魚(yú)粉、酵母浸出液等。一般來(lái)講，有機(jī)氮源更有利于微生物生長(zhǎng)。玉米漿是玉米提取玉米淀粉后留下的副產(chǎn)品。1、無(wú)機(jī)N源包括哪些？有何特點(diǎn)？問(wèn)題2、為什么說(shuō)微生物吸收利用銨鹽比硝酸鹽的能力強(qiáng)？3、無(wú)機(jī)N源是如何改變培養(yǎng)液的pH的？(NH4)2SO4→2NH3＋H2SO4NaNO3＋4H2→NH3＋H2O＋NaOH4、什么叫生理酸性物質(zhì)和生理堿性物質(zhì)？舉例說(shuō)明。1、有機(jī)N源包括哪些？有何特點(diǎn)？問(wèn)題1）成分比較復(fù)雜

2）被菌體利用的速度不同3）微生物對(duì)氨基酸的利用有選擇性

4）是引起發(fā)酵水平波動(dòng)的主要因素

3、無(wú)機(jī)鹽和微量元素

工業(yè)生產(chǎn)上，常使用合成培養(yǎng)基，因此需要添加諸如鎂、磷、鉀、硫、鈣、鈷、銅等微量元素。

常用無(wú)機(jī)鹽：KH2PO4MgSO4·7H2OKClCaCO3CuSO4·5H2O等。分別有不同作用。問(wèn)題許多金屬離子對(duì)微生物生理活性的作用與其濃度相關(guān)，低濃度時(shí)往往呈現(xiàn)刺激作用，高濃度卻表現(xiàn)出抑制作用，舉例說(shuō)明。如青霉素發(fā)酵中，發(fā)酵培養(yǎng)基中的鐵離子（Fe2+）濃度為6μg/ml時(shí)，不影響青霉素的生物合成，當(dāng)Fe2+濃度達(dá)60μg/ml時(shí)，青霉素產(chǎn)量下降30%，當(dāng)Fe2+濃度達(dá)300μg/ml時(shí)，產(chǎn)量下降90%。鋅、鎂、鈷等是某些酶的輔酶或激活劑。微量的鋅對(duì)青霉素發(fā)酵有促進(jìn)作用，過(guò)量時(shí)呈現(xiàn)抑制作用。4、水水是菌體生長(zhǎng)所必不可少的，它構(gòu)成培養(yǎng)基的主要組成成分。水在細(xì)胞中的生理功能主要有：①起到溶劑與運(yùn)輸介質(zhì)的作用，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌必須以水為介質(zhì)才能完成；②參與細(xì)胞內(nèi)一系列化學(xué)反應(yīng)；③維持蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子穩(wěn)定的天然構(gòu)象；④因?yàn)樗谋葻岣?，是熱的良好?dǎo)體，能有效地吸收代謝過(guò)程中產(chǎn)生的熱并及時(shí)地將熱迅速散發(fā)出體外，進(jìn)而有效地控制細(xì)胞內(nèi)溫度的變化；⑤保持充足的水分是細(xì)胞維持自身正常形態(tài)的重要因素；⑥微生物通過(guò)水合作用與脫水作用控制由多亞基組成的結(jié)構(gòu)，如酶、微管、鞭毛及病毒顆粒的組裝與解離。5、前體物質(zhì)和促進(jìn)劑工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中通常要添加一些有助于產(chǎn)物的形成，而對(duì)菌體生長(zhǎng)影響不大的前體物質(zhì)、抑制劑或誘導(dǎo)劑等代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)。注意：這些物質(zhì)加入到培養(yǎng)基中有助于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，而并不促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)。閱讀P34-37，回答問(wèn)題1）抗生素發(fā)酵常用前體物質(zhì)有哪些？4）名詞：前體物質(zhì)、促進(jìn)劑？2）在青霉素的生產(chǎn)過(guò)程中，為什么加入玉米漿后，青霉素的單位有很大提高？3）前體物質(zhì)是否加越多越好？5）在培養(yǎng)基中添加哪些微量的促進(jìn)劑可大大地增加某些微生物酶的產(chǎn)量？有些工業(yè)酶多數(shù)為誘導(dǎo)酶，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶等。誘導(dǎo)物的存在能大大促進(jìn)誘導(dǎo)酶的生物合成。酶的正常底物或底物的類似物都可作為誘導(dǎo)物，如淀粉、糊精或麥芽糖是淀粉酶或糖化酶的誘導(dǎo)物。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，培養(yǎng)基中必須加入誘導(dǎo)物。一些工業(yè)上重要的酶誘導(dǎo)物微生物產(chǎn)物酶誘導(dǎo)物曲霉菌產(chǎn)氣氣桿菌灰色鏈霉菌大腸桿菌枯草桿菌鏈球菌鏈霉菌曲霉菌毛霉菌綠色木霉曲霉菌α-淀粉酶普魯藍(lán)酶α-甘露糖酶青霉素?；傅鞍酌傅鞍酌傅鞍酌傅鞍酌傅鞍酌咐w維素酶果膠酶淀粉、麥芽糖麥芽糖酶母甘露糖苯乙酸許多蛋白質(zhì)許多蛋白質(zhì)許多蛋白質(zhì)許多蛋白質(zhì)許多蛋白質(zhì)纖維素果膠6）常用的促進(jìn)劑有哪些？7）名詞：抑制劑？舉例說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程中使用的一些抑制劑微生物產(chǎn)物抑制劑主要作用啤酒酵母金霉素鏈霉菌谷氨酸小球菌黑曲霉中海諾卡氏菌甘油四環(huán)素谷氨酸檸檬酸利福霉素B亞硫酸鈉溴青霉素堿金屬、磷酸二乙巴妥鹽阻止乙醛的生成阻止氯四環(huán)素的產(chǎn)生增加細(xì)胞壁透性草酸被抑制其他利福霉素被抑制6、消沫劑1）在發(fā)酵中，為什么要加消泡劑，常用哪些物質(zhì)？7、其他成分微生物生長(zhǎng)繁殖需要的生長(zhǎng)因子如維生素等，在所使用的碳源和有機(jī)氮源中含有的數(shù)量已能滿足絕大多數(shù)微生物代謝的需求，但某些微生物的培養(yǎng)基尚需加入某些微量生長(zhǎng)因子，以滿足其代謝的需要。以青霉素培養(yǎng)基為例，說(shuō)說(shuō)各成分的作用？復(fù)習(xí)：生產(chǎn)青霉素工藝培養(yǎng)基葡萄糖或乳糖總量的10%玉米漿4%-5%苯乙酸0.5%-0.8%豬油或植物油（消泡劑）0.5%PH值、K、Fe、Mn、Zn、Cu等，其余水第二節(jié)、培養(yǎng)基的種類與選擇根據(jù)培養(yǎng)基的特殊用途不同，可將培養(yǎng)基分成：

分離純化、原生質(zhì)體再生、增殖、選擇和鑒別培養(yǎng)基

根據(jù)培養(yǎng)基狀態(tài)不同，可將培養(yǎng)基分成：

固體、液體和半固體培養(yǎng)基

根據(jù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來(lái)源不同，培養(yǎng)基可分為：

天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基

問(wèn)題2固體培養(yǎng)基與半固體培養(yǎng)基是如何界定的？問(wèn)題1發(fā)酵生產(chǎn)中的培養(yǎng)基屬于哪一類培養(yǎng)基？1、培養(yǎng)基的分類生化生產(chǎn)中常用培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基問(wèn)題2起到什么作用？培養(yǎng)基配制時(shí)有哪些要求？舉例問(wèn)題1起到什么作用？培養(yǎng)基配制時(shí)有哪些要求？舉例問(wèn)題3起到什么作用？培養(yǎng)基配制時(shí)有哪些要求？第四講開(kāi)始注）培養(yǎng)基的配制原則根據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的恰當(dāng)配比（C/N）滲透壓

PH值氧化還原電位2、培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)3、培養(yǎng)基的篩選理論計(jì)算法統(tǒng)計(jì)法（單因子試驗(yàn)法、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)）連續(xù)培養(yǎng)法什么叫細(xì)胞產(chǎn)率系數(shù)？名詞消耗1克碳源底物產(chǎn)生的干微生物細(xì)胞克數(shù)。1、理論計(jì)算法碳源和能源＋氮源＋其它所需物質(zhì)細(xì)胞＋產(chǎn)物＋CO2＋H2O＋熱量2、統(tǒng)計(jì)法因子水平

A葡萄糖

%

B豆餅水解液%

C玉米漿%

D硫酸氨

%

1

2

31012.515234123543賴氨酸發(fā)酵試驗(yàn)水平和因素表3、連續(xù)培養(yǎng)法培養(yǎng)時(shí)間光密度（菌體濃度）