噬菌體抗體庫技術(shù)PPT通用課件

噬菌體抗體庫技術(shù)1.噬菌體抗體庫技術(shù)概述2.噬菌體展示系統(tǒng)3.噬菌體抗體技術(shù)的操作1.1噬菌體抗體庫技術(shù)原理1.2噬菌體抗體庫的分類1.3噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展關(guān)鍵2.1絲狀噬菌體生物學(xué)2.2噬菌體展示所使用的衣殼蛋白2.3噬菌粒與輔助噬菌體2.4多價展示與單價展示3.1抗體可變區(qū)基因的獲得3.2噬菌體抗體庫載體的構(gòu)建3.3噬菌體抗體庫的篩選3.4影響抗體庫篩選效率的因素治療性抗體的發(fā)展經(jīng)歷了異源抗體、人源化抗體和人源性抗體幾個階段。目前，人源性抗體是治療性抗體發(fā)展的主要方向，而噬茵體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)為人源性抗體的制備提供了良好的技術(shù)平臺，并且逐漸成為目前獲得人源性抗體的主要手段之一。1.1噬菌體抗體庫技術(shù)原理噬菌體抗體庫技術(shù)：聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增抗體的全套可變區(qū)基因,通過噬菌體表面展示技術(shù),把Fab段或單鏈抗體(ScFv)表達在噬菌體的表面,經(jīng)過“吸附-洗脫-擴增”過程篩選并富集特異性抗體。1.1噬菌體抗體庫技術(shù)原理構(gòu)建的噬菌體抗體庫根據(jù)其來源可分為2大類，一類為免疫抗體庫，另一類為非免疫抗體庫。免疫抗體庫的抗體基因來源于抗原免疫的個體，因此不需要很大的庫容量即可從該類抗體庫中篩選到針對某一抗原的特異性抗體。但由于免疫本身的限制性和偏向性，利用免疫抗體庫制備針對弱抗原自身抗原及具有毒性抗原的抗體均無效,而且某一特定的抗體庫只能產(chǎn)生針對特定抗原的抗體，不能作為一個廣泛應(yīng)用的平臺。1.2噬菌體抗體庫的分類非免疫抗體庫包括天然抗體庫、半合成抗體庫和全合成抗體庫。天然抗體庫是采用不經(jīng)過免疫的淋巴細(xì)胞構(gòu)建的抗體庫,半合成抗體庫是人工合成一部分可變區(qū)序列與另一部分天然序列組合構(gòu)建的抗體庫,而全合成抗體庫是指抗體可變區(qū)序列全部由人工合成。非免疫抗體庫的優(yōu)點是抗體均來源于人類,是完全的人源化抗體,但親和力通常較低,除非生成大量的抗體片段。構(gòu)建這種抗體庫的原始材料是種系的VH和/或VL基因片段或者是重排的可變區(qū)片段,在這里,一個或多個CDR要進行隨機重排。在人類的重鏈片段中,第一和第二個CDR是由種系編碼的,基本上是具有規(guī)范結(jié)構(gòu)的。而CDR3是通過D區(qū)和J區(qū)組合而成的,具有高度的多樣性,長度可以從2個氨基酸到26個氨基酸不等,是抗體多樣性和特異性的決定因素。因而,半合成抗體庫是指用人工合成長度為5~8或6一巧個氨基酸的CDR3隨機序列與人胚系可變區(qū)基因(含CDRI和CDRZ)重組而成,在體外模擬V(D)J重排所構(gòu)建的抗體庫。半合成抗體庫（1）PCR技術(shù)的發(fā)展為了大量擴增抗體基因片段，可設(shè)計一系列相應(yīng)引物，根據(jù)抗體中某些序列的相對保守性，利用不同的PCR技術(shù)簡單有效地擴增出全套抗體可變區(qū)基因。一旦多樣的IgV區(qū)基因組能夠擴增，從噬菌體抗體庫中即能得到針對不同抗原的高親和力抗體。1.3噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展關(guān)鍵（2）利用大腸埃希菌成功分泌有功能的抗體片段在抗體片段如ScFv和Fab的可變區(qū)基因序列的5‘端加入細(xì)菌的信號肽序列，抗體片段即可分泌到周質(zhì)腔，并在那里完成折疊，成為有功能的蛋白質(zhì)分子。（3）有效篩選系統(tǒng)的建立傳統(tǒng)的篩選方法使用固相化的純化抗原，依賴噬菌體顆粒對目的抗原的親和力差異來獲得較高親和力的抗體。而目前，可以在體外用完整的固化哺乳動物細(xì)胞原核細(xì)胞和組織中的天然抗原篩選噬菌體抗體片段。1.3噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展關(guān)鍵2.噬菌體展示系統(tǒng)2.1絲狀噬菌體生物學(xué)絲狀噬菌體：M13、f1和fd。單鏈DNA病毒,6407bp?；蚪M編碼11種蛋白質(zhì)，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。與展示密切相關(guān)的有兩種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。DNA在細(xì)菌內(nèi)滾環(huán)復(fù)制，細(xì)菌不被裂解，但生長速度減慢，并且分泌大量噬菌體顆粒2.1絲狀噬菌體生物學(xué)pIII蛋白結(jié)合于E.Coli的F纖毛;病毒ssDNA進入細(xì)菌的胞漿合成dsDNA；以dsDNA為模版合成所有的病毒蛋白，且通過滾環(huán)復(fù)制合成組裝病毒所需的ssDNA。第一代噬菌體在感染10分鐘后出現(xiàn)在培養(yǎng)液中（37℃）。感染后1小時內(nèi)平均每個細(xì)胞分泌1000個噬菌體。LifeCycleofM13由于M13噬菌體在增殖期間不裂解宿主菌。簡化了噬菌體純化步驟，只用簡單的PEG沉淀方法就足以將噬菌體與其他所有污染的細(xì)胞蛋白分開。2.2噬菌體展示所使用的衣殼蛋白次要衣殼蛋白pIII406aa組成，5個拷貝，位于噬菌體的尾部。由三個功能區(qū)組成：N1穿膜區(qū)：作用于E.coli細(xì)胞膜上的TolA蛋白；與噬菌體的入侵有關(guān)。N2受體結(jié)合區(qū)：負(fù)責(zé)結(jié)合F菌毛。CT疏水區(qū)：組裝前黏附在細(xì)菌內(nèi)膜上；與噬菌體組裝終止有關(guān)。G1、G2:甘氨酸片段，在感染過程中，增加各個功能域之間的靈活性。主要衣殼蛋白pVIII每個病毒子含約2700個拷貝，約10%能有效地融合外源多肽或蛋白。以pIII融合子方式表達的多肽是低價的，而以pVIII融合子方式表達的多肽則是高價的（每個病毒子~200個拷貝）。這種高價pVIII展示所增加的親和力有利于篩選到親和力非常低的配體，而低價pIII展示則將篩選限制在具有較高親和力的配體上。所有Ph.D.文庫都是pIII融合方式（每個病毒子展示5個拷貝的外源多肽）。pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?

pVIII展示的多肽比較小，如果太大會影響噬菌體殼蛋白的組裝。pIII只要不影響感染，可以展示300aa的多肽。噬菌質(zhì)粒能展示的蛋白已經(jīng)達到86kDa。絲狀噬菌體展示系統(tǒng)一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。每個病毒子含５個拷貝的pIII蛋白，這五個蛋白都可以融合短肽而不影響噬菌體的感染力?？截悢?shù)不同。2.3噬菌粒與輔助噬菌體通常用于噬菌體展示的載體有兩類：即噬菌體載體和噬菌粒載體。由于噬菌粒載體具有基因組較小、易于操作、可插入的片段較大、轉(zhuǎn)化效率高、產(chǎn)生的重組體更加穩(wěn)定等優(yōu)點，目前最常用的就是噬菌粒載體。正常情況下大腸桿菌表達的蛋白并不排出體外，需要前導(dǎo)肽,引導(dǎo)蛋白穿膜，并且在后來被剪切掉。IPTG可以誘導(dǎo)lac操縱子啟動轉(zhuǎn)錄SacI:GAGCTCXbaI:TCTAGAXhoI:CTCGAGSpeI:ACTAGTHelperphage：提供噬菌體質(zhì)粒復(fù)制、合成ssDNA和病毒包裝所需要的所有蛋白和酶。如果沒有Helperphage，噬菌粒就像質(zhì)粒一樣進行擴增。包裝后的噬菌體含有兩種不同來源的成分：噬菌體質(zhì)粒和Helperphage。使用野生型輔助噬菌體會導(dǎo)致噬菌體污染,使得僅有很少部分子代噬菌體帶有抗體片段。當(dāng)有噬菌質(zhì)粒時，由于噬菌質(zhì)粒含有野生型M13或者f1復(fù)制起始點，因此，單鏈?zhǔn)删|(zhì)粒的DNA會被優(yōu)先包裝并分泌。Helperphage2.4多價展示與單價展示使用多價展示還是單價展示的選擇與載體類型的選擇有關(guān)。帶有噬菌體正常啟動子的普通噬菌體載體一般會形成多價展示。用噬菌體質(zhì)粒時，以pIII展示為例：<10%病毒展示為單價，非常少量的展示為兩個拷貝，絕大多數(shù)只展示野生型pIII。多價展示會無法鑒定出篩選中親和性最高的克隆，因為多價位會使弱結(jié)合性克隆具有高表觀親和性。單價展示可以保證基于單純親和性的篩選。反過來，在一些初始候選者的結(jié)合性非常低的應(yīng)用中（如與一個給定靶標(biāo)結(jié)合的多肽的從頭篩選），多價位增加了分離出稀少的及弱結(jié)合性的克隆的機會。在這樣的項目中，一個常用的實驗策略就是以多價展示開始，然后當(dāng)被展示多肽的親和性成熟時，轉(zhuǎn)為單價展示。3.噬菌體抗體技術(shù)的操作3.1抗體可變區(qū)基因的獲得構(gòu)建一個噬菌體抗體庫,首先必須克隆出B細(xì)胞內(nèi)抗體的全套可變區(qū)基因?？紤]到高親和力抗體篩選所需要的步驟和抗體的多樣性,選用淋巴結(jié)細(xì)胞建庫是比較好的。目前,獲得可變區(qū)基因的途徑主要有2個:一是從基因文庫中獲取可變區(qū)基因，但這一過程相當(dāng)費時,而且由于Ig基因結(jié)構(gòu)的復(fù)雜以及大量非功能性假基因的存在,使得從基因文庫中篩選出的陽性基因并不一定是可變區(qū)基因,還需要將功能性和非功能性重排片段區(qū)別開來;二是用PCR法擴增Ig的vH和vL基因,這得益于通用引物的合成并極大地推動了基因工程抗體的研究。但用PCR法擴增某些特定位點Ig的v區(qū)基因時,必須嚴(yán)格控制PCR反應(yīng)條件,以減少非特異性“模板的完整性及濃度高低,引物的設(shè)計,退火溫度和時間的選擇,循環(huán)次數(shù)的多少等,均可能影響PCR的結(jié)果。首先提取細(xì)胞的總RNA,經(jīng)過RT-PCR擴增可變區(qū)基因酶切輕鏈PCR產(chǎn)物和表達載體二者連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中擴增成為輕鏈庫重鏈的PCR產(chǎn)物酶切酶切二者按照一定比例連接轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞加入噬菌體收集噬菌體顆粒噬菌體總抗體庫3.2噬菌體抗體庫載體的構(gòu)建單鏈抗體(ScFv)表達在噬菌體的表面3.3噬菌體抗體庫的篩選（1）親和篩選親和篩選分為直接法和間接法。直接法是將蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)到固相支持物上,文庫噬菌體與固相支持物溫育,洗去未結(jié)合的噬菌體,即獲得親和噬菌體。間接法是將生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子與文庫噬菌體溫育后鋪在結(jié)合有鏈親和素的平皿上,洗去未結(jié)合的噬菌體,保留得到的結(jié)合狀態(tài)的噬菌體。改變洗脫條件洗脫結(jié)合的噬菌體,用這部分噬菌體感染細(xì)菌,擴增后進行下一輪的篩選,通過反復(fù)幾次篩選即可得到高親和力的抗體。（2）細(xì)胞篩選親和篩選技術(shù)的前提條件是所針對抗原的性質(zhì)明確,且可獲得純品。對于無法提純或性質(zhì)不確定的抗原(如癌細(xì)胞表面受體或某種組織、細(xì)胞表面,以及在特殊分化或疾病誘導(dǎo)狀態(tài)下細(xì)胞表面的新型標(biāo)志物),親和篩選方法就不再適用。將陽性抗原細(xì)胞用熒光素或生物素標(biāo)記后與陰性抗原細(xì)胞混合,再加入抗體庫溫育,最后通過流式細(xì)胞術(shù)或磁珠分離。用細(xì)胞系從單鏈抗體庫中篩選出了與細(xì)胞表面受體結(jié)合的噬菌體抗體。但細(xì)胞篩選在應(yīng)用中仍存在一定難度,表現(xiàn)為非特異性大、背景值高、洗滌過程中特異性配體損失等。這主要由于細(xì)胞膜表面成分極其復(fù)雜,有許多蛋白、糖類、脂類結(jié)構(gòu),非特異性噬菌體抗體結(jié)合到細(xì)胞表面的幾率更大,且膜表面抗原密度很低,很難獲得針對某一抗原的單鏈抗體。（3）體內(nèi)篩選體內(nèi)篩選適用于無法分離培養(yǎng)用于篩選的細(xì)胞,或抗體與體內(nèi)細(xì)胞間的相互作用過于復(fù)雜無法在體外實現(xiàn)的情況。使用體內(nèi)篩選時將噬菌體抗體庫注射入動物機體,回收動物器官分離抗體,再經(jīng)過多輪的篩選,擴增,純化得到目的抗體。但由于該方法涉及體內(nèi)的多種生物學(xué)過程,影響因素多且無法預(yù)測,成功率低,還有待于進一步的發(fā)展。3.4影響抗體庫篩選效率的因素（1）庫容量通常篩選庫容量較小的抗體庫(E7~E8)時,在前幾輪采用中等的嚴(yán)謹(jǐn)度有利于避免高親和性低表達的克隆的丟失,而對較大的抗體庫的篩選,則可采用較高的嚴(yán)謹(jǐn)度以便較快地富集親和性克隆。（2）去污劑在結(jié)合或清洗Buffer中添加去污劑（通常是Tween-20