噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)PPT通用課件

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)1.噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)概述2.噬菌體展示系統(tǒng)3.噬菌體抗體技術(shù)的操作1.1噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)原理1.2噬菌體抗體庫(kù)的分類(lèi)1.3噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的發(fā)展關(guān)鍵2.1絲狀噬菌體生物學(xué)2.2噬菌體展示所使用的衣殼蛋白2.3噬菌粒與輔助噬菌體2.4多價(jià)展示與單價(jià)展示3.1抗體可變區(qū)基因的獲得3.2噬菌體抗體庫(kù)載體的構(gòu)建3.3噬菌體抗體庫(kù)的篩選3.4影響抗體庫(kù)篩選效率的因素治療性抗體的發(fā)展經(jīng)歷了異源抗體、人源化抗體和人源性抗體幾個(gè)階段。目前，人源性抗體是治療性抗體發(fā)展的主要方向，而噬茵體抗體庫(kù)技術(shù)的出現(xiàn)為人源性抗體的制備提供了良好的技術(shù)平臺(tái)，并且逐漸成為目前獲得人源性抗體的主要手段之一。1.1噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)原理噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)：聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增抗體的全套可變區(qū)基因,通過(guò)噬菌體表面展示技術(shù),把Fab段或單鏈抗體(ScFv)表達(dá)在噬菌體的表面,經(jīng)過(guò)“吸附-洗脫-擴(kuò)增”過(guò)程篩選并富集特異性抗體。1.1噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)原理構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)根據(jù)其來(lái)源可分為2大類(lèi)，一類(lèi)為免疫抗體庫(kù)，另一類(lèi)為非免疫抗體庫(kù)。免疫抗體庫(kù)的抗體基因來(lái)源于抗原免疫的個(gè)體，因此不需要很大的庫(kù)容量即可從該類(lèi)抗體庫(kù)中篩選到針對(duì)某一抗原的特異性抗體。但由于免疫本身的限制性和偏向性，利用免疫抗體庫(kù)制備針對(duì)弱抗原自身抗原及具有毒性抗原的抗體均無(wú)效,而且某一特定的抗體庫(kù)只能產(chǎn)生針對(duì)特定抗原的抗體，不能作為一個(gè)廣泛應(yīng)用的平臺(tái)。1.2噬菌體抗體庫(kù)的分類(lèi)非免疫抗體庫(kù)包括天然抗體庫(kù)、半合成抗體庫(kù)和全合成抗體庫(kù)。天然抗體庫(kù)是采用不經(jīng)過(guò)免疫的淋巴細(xì)胞構(gòu)建的抗體庫(kù),半合成抗體庫(kù)是人工合成一部分可變區(qū)序列與另一部分天然序列組合構(gòu)建的抗體庫(kù),而全合成抗體庫(kù)是指抗體可變區(qū)序列全部由人工合成。非免疫抗體庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)是抗體均來(lái)源于人類(lèi),是完全的人源化抗體,但親和力通常較低,除非生成大量的抗體片段。構(gòu)建這種抗體庫(kù)的原始材料是種系的VH和/或VL基因片段或者是重排的可變區(qū)片段,在這里,一個(gè)或多個(gè)CDR要進(jìn)行隨機(jī)重排。在人類(lèi)的重鏈片段中,第一和第二個(gè)CDR是由種系編碼的,基本上是具有規(guī)范結(jié)構(gòu)的。而CDR3是通過(guò)D區(qū)和J區(qū)組合而成的,具有高度的多樣性,長(zhǎng)度可以從2個(gè)氨基酸到26個(gè)氨基酸不等,是抗體多樣性和特異性的決定因素。因而,半合成抗體庫(kù)是指用人工合成長(zhǎng)度為5~8或6一巧個(gè)氨基酸的CDR3隨機(jī)序列與人胚系可變區(qū)基因(含CDRI和CDRZ)重組而成,在體外模擬V(D)J重排所構(gòu)建的抗體庫(kù)。半合成抗體庫(kù)（1）PCR技術(shù)的發(fā)展為了大量擴(kuò)增抗體基因片段，可設(shè)計(jì)一系列相應(yīng)引物，根據(jù)抗體中某些序列的相對(duì)保守性，利用不同的PCR技術(shù)簡(jiǎn)單有效地?cái)U(kuò)增出全套抗體可變區(qū)基因。一旦多樣的IgV區(qū)基因組能夠擴(kuò)增，從噬菌體抗體庫(kù)中即能得到針對(duì)不同抗原的高親和力抗體。1.3噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的發(fā)展關(guān)鍵（2）利用大腸埃希菌成功分泌有功能的抗體片段在抗體片段如ScFv和Fab的可變區(qū)基因序列的5‘端加入細(xì)菌的信號(hào)肽序列，抗體片段即可分泌到周質(zhì)腔，并在那里完成折疊，成為有功能的蛋白質(zhì)分子。（3）有效篩選系統(tǒng)的建立傳統(tǒng)的篩選方法使用固相化的純化抗原，依賴(lài)噬菌體顆粒對(duì)目的抗原的親和力差異來(lái)獲得較高親和力的抗體。而目前，可以在體外用完整的固化哺乳動(dòng)物細(xì)胞原核細(xì)胞和組織中的天然抗原篩選噬菌體抗體片段。1.3噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的發(fā)展關(guān)鍵2.噬菌體展示系統(tǒng)2.1絲狀噬菌體生物學(xué)絲狀噬菌體：M13、f1和fd。單鏈DNA病毒,6407bp?；蚪M編碼11種蛋白質(zhì)，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。與展示密切相關(guān)的有兩種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。DNA在細(xì)菌內(nèi)滾環(huán)復(fù)制，細(xì)菌不被裂解，但生長(zhǎng)速度減慢，并且分泌大量噬菌體顆粒2.1絲狀噬菌體生物學(xué)pIII蛋白結(jié)合于E.Coli的F纖毛;病毒ssDNA進(jìn)入細(xì)菌的胞漿合成dsDNA；以dsDNA為模版合成所有的病毒蛋白，且通過(guò)滾環(huán)復(fù)制合成組裝病毒所需的ssDNA。第一代噬菌體在感染10分鐘后出現(xiàn)在培養(yǎng)液中（37℃）。感染后1小時(shí)內(nèi)平均每個(gè)細(xì)胞分泌1000個(gè)噬菌體。LifeCycleofM13由于M13噬菌體在增殖期間不裂解宿主菌。簡(jiǎn)化了噬菌體純化步驟，只用簡(jiǎn)單的PEG沉淀方法就足以將噬菌體與其他所有污染的細(xì)胞蛋白分開(kāi)。2.2噬菌體展示所使用的衣殼蛋白次要衣殼蛋白pIII406aa組成，5個(gè)拷貝，位于噬菌體的尾部。由三個(gè)功能區(qū)組成：N1穿膜區(qū)：作用于E.coli細(xì)胞膜上的TolA蛋白；與噬菌體的入侵有關(guān)。N2受體結(jié)合區(qū)：負(fù)責(zé)結(jié)合F菌毛。CT疏水區(qū)：組裝前黏附在細(xì)菌內(nèi)膜上；與噬菌體組裝終止有關(guān)。G1、G2:甘氨酸片段，在感染過(guò)程中，增加各個(gè)功能域之間的靈活性。主要衣殼蛋白pVIII每個(gè)病毒子含約2700個(gè)拷貝，約10%能有效地融合外源多肽或蛋白。以pIII融合子方式表達(dá)的多肽是低價(jià)的，而以pVIII融合子方式表達(dá)的多肽則是高價(jià)的（每個(gè)病毒子~200個(gè)拷貝）。這種高價(jià)pVIII展示所增加的親和力有利于篩選到親和力非常低的配體，而低價(jià)pIII展示則將篩選限制在具有較高親和力的配體上。所有Ph.D.文庫(kù)都是pIII融合方式（每個(gè)病毒子展示5個(gè)拷貝的外源多肽）。pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?

pVIII展示的多肽比較小，如果太大會(huì)影響噬菌體殼蛋白的組裝。pIII只要不影響感染，可以展示300aa的多肽。噬菌質(zhì)粒能展示的蛋白已經(jīng)達(dá)到86kDa。絲狀噬菌體展示系統(tǒng)一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。每個(gè)病毒子含５個(gè)拷貝的pIII蛋白，這五個(gè)蛋白都可以融合短肽而不影響噬菌體的感染力?？截悢?shù)不同。2.3噬菌粒與輔助噬菌體通常用于噬菌體展示的載體有兩類(lèi)：即噬菌體載體和噬菌粒載體。由于噬菌粒載體具有基因組較小、易于操作、可插入的片段較大、轉(zhuǎn)化效率高、產(chǎn)生的重組體更加穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，目前最常用的就是噬菌粒載體。正常情況下大腸桿菌表達(dá)的蛋白并不排出體外，需要前導(dǎo)肽,引導(dǎo)蛋白穿膜，并且在后來(lái)被剪切掉。IPTG可以誘導(dǎo)lac操縱子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄SacI:GAGCTCXbaI:TCTAGAXhoI:CTCGAGSpeI:ACTAGTHelperphage：提供噬菌體質(zhì)粒復(fù)制、合成ssDNA和病毒包裝所需要的所有蛋白和酶。如果沒(méi)有Helperphage，噬菌粒就像質(zhì)粒一樣進(jìn)行擴(kuò)增。包裝后的噬菌體含有兩種不同來(lái)源的成分：噬菌體質(zhì)粒和Helperphage。使用野生型輔助噬菌體會(huì)導(dǎo)致噬菌體污染,使得僅有很少部分子代噬菌體帶有抗體片段。當(dāng)有噬菌質(zhì)粒時(shí)，由于噬菌質(zhì)粒含有野生型M13或者f1復(fù)制起始點(diǎn)，因此，單鏈?zhǔn)删|(zhì)粒的DNA會(huì)被優(yōu)先包裝并分泌。Helperphage2.4多價(jià)展示與單價(jià)展示使用多價(jià)展示還是單價(jià)展示的選擇與載體類(lèi)型的選擇有關(guān)。帶有噬菌體正常啟動(dòng)子的普通噬菌體載體一般會(huì)形成多價(jià)展示。用噬菌體質(zhì)粒時(shí)，以pIII展示為例：<10%病毒展示為單價(jià)，非常少量的展示為兩個(gè)拷貝，絕大多數(shù)只展示野生型pIII。多價(jià)展示會(huì)無(wú)法鑒定出篩選中親和性最高的克隆，因?yàn)槎鄡r(jià)位會(huì)使弱結(jié)合性克隆具有高表觀(guān)親和性。單價(jià)展示可以保證基于單純親和性的篩選。反過(guò)來(lái)，在一些初始候選者的結(jié)合性非常低的應(yīng)用中（如與一個(gè)給定靶標(biāo)結(jié)合的多肽的從頭篩選），多價(jià)位增加了分離出稀少的及弱結(jié)合性的克隆的機(jī)會(huì)。在這樣的項(xiàng)目中，一個(gè)常用的實(shí)驗(yàn)策略就是以多價(jià)展示開(kāi)始，然后當(dāng)被展示多肽的親和性成熟時(shí)，轉(zhuǎn)為單價(jià)展示。3.噬菌體抗體技術(shù)的操作3.1抗體可變區(qū)基因的獲得構(gòu)建一個(gè)噬菌體抗體庫(kù),首先必須克隆出B細(xì)胞內(nèi)抗體的全套可變區(qū)基因?？紤]到高親和力抗體篩選所需要的步驟和抗體的多樣性,選用淋巴結(jié)細(xì)胞建庫(kù)是比較好的。目前,獲得可變區(qū)基因的途徑主要有2個(gè):一是從基因文庫(kù)中獲取可變區(qū)基因，但這一過(guò)程相當(dāng)費(fèi)時(shí),而且由于Ig基因結(jié)構(gòu)的復(fù)雜以及大量非功能性假基因的存在,使得從基因文庫(kù)中篩選出的陽(yáng)性基因并不一定是可變區(qū)基因,還需要將功能性和非功能性重排片段區(qū)別開(kāi)來(lái);二是用PCR法擴(kuò)增Ig的vH和vL基因,這得益于通用引物的合成并極大地推動(dòng)了基因工程抗體的研究。但用PCR法擴(kuò)增某些特定位點(diǎn)Ig的v區(qū)基因時(shí),必須嚴(yán)格控制PCR反應(yīng)條件,以減少非特異性“模板的完整性及濃度高低,引物的設(shè)計(jì),退火溫度和時(shí)間的選擇,循環(huán)次數(shù)的多少等,均可能影響PCR的結(jié)果。首先提取細(xì)胞的總RNA,經(jīng)過(guò)RT-PCR擴(kuò)增可變區(qū)基因酶切輕鏈PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體二者連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中擴(kuò)增成為輕鏈庫(kù)重鏈的PCR產(chǎn)物酶切酶切二者按照一定比例連接轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞加入噬菌體收集噬菌體顆粒噬菌體總抗體庫(kù)3.2噬菌體抗體庫(kù)載體的構(gòu)建單鏈抗體(ScFv)表達(dá)在噬菌體的表面3.3噬菌體抗體庫(kù)的篩選（1）親和篩選親和篩選分為直接法和間接法。直接法是將蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)到固相支持物上,文庫(kù)噬菌體與固相支持物溫育,洗去未結(jié)合的噬菌體,即獲得親和噬菌體。間接法是將生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子與文庫(kù)噬菌體溫育后鋪在結(jié)合有鏈親和素的平皿上,洗去未結(jié)合的噬菌體,保留得到的結(jié)合狀態(tài)的噬菌體。改變洗脫條件洗脫結(jié)合的噬菌體,用這部分噬菌體感染細(xì)菌,擴(kuò)增后進(jìn)行下一輪的篩選,通過(guò)反復(fù)幾次篩選即可得到高親和力的抗體。（2）細(xì)胞篩選親和篩選技術(shù)的前提條件是所針對(duì)抗原的性質(zhì)明確,且可獲得純品。對(duì)于無(wú)法提純或性質(zhì)不確定的抗原(如癌細(xì)胞表面受體或某種組織、細(xì)胞表面,以及在特殊分化或疾病誘導(dǎo)狀態(tài)下細(xì)胞表面的新型標(biāo)志物),親和篩選方法就不再適用。將陽(yáng)性抗原細(xì)胞用熒光素或生物素標(biāo)記后與陰性抗原細(xì)胞混合,再加入抗體庫(kù)溫育,最后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)或磁珠分離。用細(xì)胞系從單鏈抗體庫(kù)中篩選出了與細(xì)胞表面受體結(jié)合的噬菌體抗體。但細(xì)胞篩選在應(yīng)用中仍存在一定難度,表現(xiàn)為非特異性大、背景值高、洗滌過(guò)程中特異性配體損失等。這主要由于細(xì)胞膜表面成分極其復(fù)雜,有許多蛋白、糖類(lèi)、脂類(lèi)結(jié)構(gòu),非特異性噬菌體抗體結(jié)合到細(xì)胞表面的幾率更大,且膜表面抗原密度很低,很難獲得針對(duì)某一抗原的單鏈抗體。（3）體內(nèi)篩選體內(nèi)篩選適用于無(wú)法分離培養(yǎng)用于篩選的細(xì)胞,或抗體與體內(nèi)細(xì)胞間的相互作用過(guò)于復(fù)雜無(wú)法在體外實(shí)現(xiàn)的情況。使用體內(nèi)篩選時(shí)將噬菌體抗體庫(kù)注射入動(dòng)物機(jī)體,回收動(dòng)物器官分離抗體,再經(jīng)過(guò)多輪的篩選,擴(kuò)增,純化得到目的抗體。但由于該方法涉及體內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程,影響因素多且無(wú)法預(yù)測(cè),成功率低,還有待于進(jìn)一步的發(fā)展。3.4影響抗體庫(kù)篩選效率的因素（1）庫(kù)容量通常篩選庫(kù)容量較小的抗體庫(kù)(E7~E8)時(shí),在前幾輪采用中等的嚴(yán)謹(jǐn)度有利于避免高親和性低表達(dá)的克隆的丟失,而對(duì)較大的抗體庫(kù)的篩選,則可采用較高的嚴(yán)謹(jǐn)度以便較快地富集親和性克隆。（2）去污劑在結(jié)合或清洗Buffer中添加去污劑（通常是Tween-20