第五章酶分子修飾

第五章酶的分子修飾Chapter5ModificationofEnzymeMoleculeContentsofchapter5第一節(jié)概述第二節(jié)酶的金屬離子置換修飾第三節(jié)酶的大分子修飾第四節(jié)酶分子的側(cè)鏈基團修飾GoGoGoGo第八節(jié)酶的定向進化GoGoGoGoGo第五節(jié)酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)第六節(jié)氨基酸置換修飾第七節(jié)酶分子的物理修飾第九節(jié)酶分子修飾的應(yīng)用第一節(jié)概述

一、什么是酶分子修飾？通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)基團（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進行共價連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。二、酶分子修飾方法金屬離子置換修飾大分子結(jié)合修飾肽鏈有限水解修飾酶蛋白側(cè)鏈基團修飾氨基酸置換修飾酶分子的物理修飾三、酶分子修飾的意義酶是一種特殊的蛋白質(zhì)，有巨大的利用價值。而酶同時也存在著許多缺陷，如大多數(shù)酶對酸、堿、重金屬、有機介質(zhì)、高溫等物理或化學(xué)環(huán)境條件異常敏感。還有些酶的活性、作用專一性和作用條件常常不能滿足生產(chǎn)工藝的要求，這就影響了一些酶的商業(yè)用途。人們希望工業(yè)用酶能有較強的抗酸、堿、高溫及耐有機溶劑的能力，希望藥用酶蛋白低毒甚至無毒，具有活性高、作用時間長的特點。為了讓酶滿足人類需求，科學(xué)家試圖改造蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來達到這一目的。其中一種方法是通過基因定點突變，有選擇地改造蛋白質(zhì)分子，20世紀80年代初，蛋白質(zhì)工程應(yīng)運而生；其中另一種方法是用化學(xué)試劑與酶的某些基團結(jié)合，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和催化特性，這就是酶的化學(xué)修飾技術(shù)。三、酶分子修飾的意義改變酶的作用特性。包括改變酶的活性，作用專一性，對效應(yīng)物的響應(yīng)等等。增強酶的穩(wěn)定性。如引入一些親水基，增強酶對介質(zhì)的親和性，使酶的穩(wěn)定性得到提高。降低或消除酶的抗原性。防止酶在體內(nèi)被降解或引起免疫反應(yīng)。如采用分子化合物進行修飾，或采用水溶性大分子進行保護性修飾，使醫(yī)藥用酶與免疫系統(tǒng)、蛋白水解系統(tǒng)隔離。研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響表5-3天然酶和修飾酶抗失活因子能力比較酶抗抑制劑抗蛋白酶修飾劑抗失活劑過氧化氫酶核糖核酸酶溶菌酶胰蛋白酶-葡萄糖苷酶尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷白蛋白右旋糖苷抗胰蛋白酶抗蛋白酶抗糜蛋白酶抗胰蛋白酶抗SDS抗大豆抑制劑抗胃蛋白酶抗胎盤抑制劑——抗尿素抗SDS表5-4天然酶與修飾酶的半衰期比較酶羧肽酶Arg酶Gln-Asn酶尿酸酶超氧化物岐化酶過氧化氫酶修飾劑半衰期天然酶修飾酶白蛋白白蛋白糖肽右旋糖苷右旋糖苷PEG3.5h17h1.4h1h4h6min6h12h8h20h4h8h表5-5天然酶與修飾酶的最適pH酶修飾酶天然酶修飾劑糜蛋白酶豬肝尿酸酶吲哚-3-鏈烷羥化酶豬肝尿酸酶產(chǎn)沅假絲酵母尿酸酶白蛋白PEGPEG聚丙烯酸肝素10.57.4-8.55.0-5.59.08.83.58.28.28.09.0四、酶分子修飾的基本要求和條件

對酶分子進行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。（1）酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。（2）酶活性中心的狀況

活性中心基團、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。酶分子修飾的條件修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團，使修飾率高，同時酶的活力回收高。（1）pH與離子強度

pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。（2）修飾反應(yīng)的溫度與時間

嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。（3）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例

回本章目錄五酶修飾后的性質(zhì)變化熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高?？乖裕罕容^公認的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰期。最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大。第二節(jié)酶的金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。α-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的鋅離子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+)若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。若用另一種金屬離子進行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。金屬離子置換修飾的過程a.酶的分離純化：首先將欲進行修飾的酶經(jīng)過分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。

b.除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時，酶往往成為無活性狀態(tài)。

c.加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。

經(jīng)過金屬離子置換后的酶，往往呈現(xiàn)不同的催化特性。如，一般天然α淀粉酶是雜離子型的，其中大部分含有鈣離子，有些則含有鎂離子、鋅離子或其它金屬離子。如將其它離子都換成鈣離子，成為鈣型α淀粉酶，研究表明：結(jié)晶鈣型α淀粉酶比天然雜離子型α淀粉酶的穩(wěn)定性提高3倍以上。在α淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)、保存和應(yīng)用過程中添加一定量的鈣離子，有利于提高和穩(wěn)定α淀粉酶的活力。Zn型蛋白酶的Zn2+被Ca2+置換，所得的鈣型蛋白酶活性提高20％-30％，若制成結(jié)晶，酶活可提高2-3倍。金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。第三節(jié)酶的大分子修飾使用一些能與酶非共價地相互作用而又能有效地保護酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來保護酶的活力。另一類添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用時，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。非共價修飾用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達到原有酶活力的5.1倍共價修飾大分子修飾(共價)的過程修飾劑的選擇：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團往往不能直接與酶分子的基團進行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團進行反應(yīng)。修飾：將帶有活化基團的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時間，使修飾劑的活化基團與酶分子的某側(cè)鏈基團以共價鍵結(jié)合，對酶分子進行修飾。分離：需要通過凝膠層析等方法進行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。酶

半衰期相對穩(wěn)定性

天然SOD6min1

右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240

聚乙二醇-SOD

35h

350大分子修飾后酶性質(zhì)的變化（1）提高酶活力（2）增加酶的穩(wěn)定性半衰期：酶活力降低原來活力一半所經(jīng)過的時間。（3）降低抗原抗體反應(yīng)

（1）通過分子結(jié)合修飾可以提高酶活力：如，每分子胰凝乳蛋白酶與n分子的右旋糖酐結(jié)合，酶活力達到原有酶的5.1倍：糖分子上的鄰雙羥基在溴化氰的作用下活化，然后在堿性條件下，與酶分子上的氨基反應(yīng)而共價結(jié)合。（2）通過分子結(jié)合修飾，可以增加酶的穩(wěn)定性PEG分子末端有兩個可被活化的羥基，但化學(xué)修飾時多采用單甲氧基聚乙二醇（MPEG），只帶一個可被活化的羥基?！锩傅姆€(wěn)定性用酶的半衰期表示。所謂酶的半衰期是指酶的活力降低到原來活力一半時所經(jīng)過的時間。例如，超氧化物歧化酶（SOD）可清除細胞外液中存在的超氧陰離子（），作為抗衰老和抑制炎癥的藥物，其穩(wěn)定性及在體內(nèi)的半衰期僅6~10min，影響了藥用效果。實驗證明，用聚乙二醇或右旋糖酐、聚蔗糖分別對該酶Lys(賴)上的ε—NH2進行修飾后，分子量明顯增大，SOD在血液中的半衰期可以從原來的6min增加到幾h，最高達到35h。（3）通過修飾降低或消除酶蛋白的抗原性酶蛋白大多是從微生物、植物或動物中獲得的。對人體來說是一種外源蛋白質(zhì)，當(dāng)外源酶蛋白非經(jīng)口（注射等）進入人體后，往往會成為一種抗原，刺激體內(nèi)產(chǎn)生抗體。產(chǎn)生的抗體可與作為抗原的酶特異地結(jié)合，使酶失去其催化功能。消除抗原性公認的修飾劑是聚乙二醇（PEG）（Mr=500~20000D）聚乙二醇（PEG）是線性分子，具有較好的生物相容性。聚乙二醇在體內(nèi)不殘留、無毒性和抗原性，它的末端羥基經(jīng)活化后可與酶反應(yīng)產(chǎn)生交聯(lián)。如，L—天冬酰胺酶經(jīng)聚乙二醇結(jié)合修飾后，抗原性完全消除（修飾方法同上）。L—天冬酰胺酶具有較強的抗腫瘤作用。當(dāng)天冬酰胺酶注射進入人體后,人體的正常細胞內(nèi)由于有天冬酰胺合成酶,可以合成L-天冬酰胺而使蛋白質(zhì)的合成不受影響.而對于缺乏天冬酰胺合成酶的癌細胞來說,由于本身不能合成天冬酰胺,外來的天冬酰胺又被L-天冬酰胺酶分解掉,(它能將腫瘤細胞生長所需的L—天冬酰胺水解為天冬氨酸和氨.)因此蛋白質(zhì)合成受阻,從而導(dǎo)致癌細胞死亡.從而特異地、有效地抑制腫瘤細胞的生長。在國內(nèi)外，是治療淋巴性白血病、惡性淋巴腫瘤，治療指數(shù)最高的藥物。但由于它來源于微生物，對人而言是一種外源蛋白質(zhì)，有較強的免疫原性。研究表明，用聚乙二醇修飾能較好地克服這一缺陷。1994年，美國FDA正式批準(zhǔn)該藥在美國上市。商品名為Oncaspar。PEG修飾的人血紅蛋白，可作為血漿代用品，冷凍干燥后可永久保存，輸血與血型無關(guān)，避免輸血時可能發(fā)生的肝炎或艾滋病毒感染。第四節(jié)酶分子的側(cè)鏈基團修飾采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶蛋白的側(cè)鏈基團發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法?？梢杂糜谘芯扛鞣N基團在酶分子中的作用及其對酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響。在研究酶的活性中心中的必需基團時經(jīng)常采用。酶蛋白的側(cè)鏈基團是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。這些基團可以形成各種副鍵，對酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有重要作用。側(cè)鏈基團一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。催化活性/非催化活性基團的修飾對非催化基團修飾可改變酶的動力學(xué)性質(zhì)，改變酶對特殊底物的束縛能力。

經(jīng)常被修飾的殘基是： 親核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 親電的Tyr、Trp對催化活性基團可以通過選擇性修飾側(cè)鏈成分來實現(xiàn)氨基酸的取代。1．氨基修飾例如，天冬酰胺酶是一種抗白血病的藥物，注入體內(nèi)后很容易被代謝。為此，用亞硝酸修飾天冬酰胺酶N—末端Ile(異亮)的氨基與肽鏈中Lys(賴)的ε—氨基，脫去氨基后，變成羥基，酶活力不變，但在體內(nèi)的半衰期延長2倍，療效顯著提高。用O—甲基異脲修飾溶菌酶，使酶分子中賴氨酸殘基上的氨基與它結(jié)合，將氨基屏蔽起來，修飾后，酶活力基本不變，但穩(wěn)定性顯著起高，而且很容易形成結(jié)晶。凡能使蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的氨基發(fā)生改變的化合物，稱為氨基修飾劑，主要有亞硝酸、二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亞胺甲酯。O—甲基異脲、順丁烯二酸酐等。氨基修飾劑可以使側(cè)鏈氨基發(fā)生脫氨基作用，或者與氨基共價結(jié)合將氨基屏蔽起來。2．羧基修飾常用的羧基修飾劑有：碳二亞胺、乙醇—鹽酸試劑、異惡唑鹽等。其中水溶性的碳二亞胺類特定的修飾酶的羧基已成為最普遍的標(biāo)準(zhǔn)方法，它在比較溫和的條件下就可以進行。3．胍基修飾蛋白質(zhì)分子中精氨酸殘基的側(cè)鏈?zhǔn)请一?。采用二羰基化合物與胍基反應(yīng)生成穩(wěn)定的雜環(huán)改變酶分子的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的方法稱為胍基修飾。胍基修飾劑有：環(huán)己二酮、丙二醛、苯乙二醛等。巰基在維持亞基間的相互作用和酶催化過程中起重要作用，巰基具有很強的親核性，在含有半胱氨酸的酶分子中是最容易反應(yīng)的側(cè)鏈基團。已經(jīng)開發(fā)了許多修飾巰基的特異性修飾劑。其中Ellman試劑[DTNB,5’5’-二硫代-雙（2-硝基）苯甲酸]是最常用的巰基修飾劑，可以對酶分子中巰基的數(shù)目進行定量，用于研究巰基改變程度和巰基所處的環(huán)境以及蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。4．巰基修飾[DTNB,5’5’-二硫代-雙（2-硝基）苯甲酸]DTNB與巰基反應(yīng)形成二硫鍵，釋放出1個2-硝基-5-硫代苯甲酸陰離子，此陰離子在412nm處有最大吸收，因此能夠通過光吸收的變化跟蹤反應(yīng)程度。5．酚基修飾修飾酶蛋白酪氨酸殘基的酚環(huán)。有硝化法，琥珀?；?、碘化法等。四硝基甲烷（TNM）琥珀酸酐焦碳酸二乙酯（DPC）+CH3CH2OH+CO2碘代乙酸組氨酸殘基位于許多酶的活性中心，常用的修飾劑有焦碳酸二乙酯（DPC）和碘代乙酸。DPC在近中性的PH下對組氨酸殘基有較好的專一性，產(chǎn)物在240nm處有最大吸收，可跟蹤反應(yīng)和定量。6．咪唑基修飾雙功能試劑分子兩端功能基團的反應(yīng)活性，可以在相隔較近的兩個氨基酸殘基之間，或酶與其它分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。近年來，設(shè)計了一些對稱的“雙頭”試劑，可以在相隔較近的兩個氨基酸殘基之間搭橋，形成多肽鏈內(nèi)的交聯(lián)，而不引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的重大改變，這種試劑稱為雙功能試劑。如戊二醛、乙二胺、二氨基丁烷等。7．分子內(nèi)交聯(lián)修飾第五節(jié)酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。通過主鏈修飾，可以知道酶活性中心在主鏈上的位置，了解主鏈不同位置對酶催化功能的貢獻。酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。胃蛋白酶原的激活1．主鏈的切斷修飾主鏈切斷后，可能出現(xiàn)下列3種情況：①主鏈切斷后，酶活性中心遭到破壞、酶失活。這種修飾主要用于探測酶活性中心的位置。②主鏈切斷后，仍可保持酶活性中心的構(gòu)象，酶的催化功能可以保持不變或損失不多，同時酶的抗原性降低或消失。有些酶蛋白具有抗原性。酶的抗原性與其分子大小有關(guān)，大分子的外源蛋白往往有較強的抗原性，而小分子蛋白或肽段的抗原性較低或無抗原性。采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ姑阜肿与逆溤谔囟ǖ奈稽c切斷，其相對分子量減小，就有可能在基本保持酶活力的同時，使酶的抗原性降低或消失，這種修飾方法又稱為“肽鏈的有限水解修飾”。例如：木瓜蛋白酶，用亮氨酸氨肽酶進行有限水解，切除其肽鏈的三分之二，該酶的活力基本保持，其抗原性卻大大降低；酵母的烯醇化酶有限水解，切除150個氨基酸殘基的肽段后，酶活力仍然保持，抗原性卻顯著降低。③若主鏈的斷裂有利于酶活性中心的形成，則在切斷修飾之后，酶蛋白顯示其催化功能或酶活力的提高。例如，胰蛋白酶酶原，用腸激酶或胰蛋白酶進行修飾，切除一個六肽，從而顯示胰蛋白酶的催化功能。天冬氨酸酶經(jīng)過胰蛋白酶修飾，從C末端切除10多個氨基酸殘基的肽段，可以使天冬氨酸酶的活力提高5.5倍。這說明天然酶并不總是處于最佳構(gòu)象狀態(tài)。胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活2．主鏈連接修飾——“多酶融合體”主鏈連接修飾是通過基因融合技術(shù)，將兩種或兩種以上的酶的基因融合在一起形成的融合基因，再經(jīng)過克隆和表達，獲得各種多酶融合體。所謂多酶融合體是具有兩種或兩種以上催化活性的酶連接在一條肽鏈上，往往是基因融合的產(chǎn)物。它可以是單體酶，也可以是寡聚酶。例如：天冬氨酶激酶——高絲氨酸脫氫酶融合體是α4四聚體（Mr=4×86KD）。每條肽鏈含有兩個活性區(qū)域：N-端部分的天冬氨酸激酶和C-端部分的高絲氨酸脫氫酶。這兩個活性區(qū)域用蛋白酶水解切開后，分別具有兩種酶的催化活性，這種一條肽鏈連接兩種不同酶活性的酶稱為“雙頭酶”。3．主鏈剪接修飾迄今，主鏈剪接修飾主要靠酶法。例如，人和豬的胰島素，僅在β鏈C端有一個氨基酸的差別。在無色桿菌蛋白酶作用下，將豬胰島素β鏈C末端的Ala(丙)水解下來，然后用同一酶將Thr(蘇)接上去，即可將豬胰島素轉(zhuǎn)變成人胰島素。丹麥的NOVO公司用兩年時間，已將這項成果工業(yè)化。氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法，例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對酶分子逐個進行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。

現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點突變技術(shù)。定點突變（sitedirectedmutagenesis）是20世紀80年代發(fā)展起來的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點上進行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。定點突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進、可靠、行之有效的手段。第六節(jié)氨基酸置換修飾酶分子的定點突變1、基因序列分析2、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析3、酶活性中心分析4、引物設(shè)計進行基因定點突變5、酶基因克隆表達6、變異特性分析酶修飾酶性質(zhì)的改變修飾部位原氨基酸殘基→新氨基酸殘基酪氨酰-tRNA合成酶51ThrPro對底物ATP的親和力提高100倍T4—溶菌酶3IleCys熱穩(wěn)定性提高β—內(nèi)酰胺酶70→7170→71Ser·ThrThr·SerThr·SerSer·Ser完全失活恢復(fù)活性嗜菌體T4溶菌酶分子中沒有二硫鍵，但含有二個巰基，（Cys54，Cys97），其中Cys(半胱)97靠近三級結(jié)構(gòu)中的N末端，且與Ile3(異亮)很靠近，用定點突變法將Ile3突變成Cys3后，在溫和條件下氧化，形成二硫鍵。Perry等人證明，天然酶與突變體酶的構(gòu)象是一樣的，催化活力相同，但由于在酶分子中引入新的二硫鍵，使酶的結(jié)構(gòu)更牢固，突變體酶的熱穩(wěn)定性顯著高于天然酶。第七節(jié)酶分子的物理修飾通過物理修飾，可以了解不同物理條件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。特點在于不改變酶的組成單位及其基團，酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。例如，高壓處理纖維素酶，該酶的最適溫度有所降低，在30℃~40℃條件下，比天然酶的活力提高10%；天冬氨酸甲酰轉(zhuǎn)移酶在12000Pa壓力下處理以后，酶活力提高三倍。高壓處理甚至可改變酶的底物專一性。羧肽酶γ經(jīng)高壓處理，底物專一性發(fā)生改變。其水解能力降低，而有利于催化多肽的合成反應(yīng)。天冬氨酸酶經(jīng)高壓處理一定時間后，可以催化D—Asp的氨解反應(yīng)。一般認為，蛋白質(zhì)在壓力的影響下，會改變它的體積、構(gòu)象及活性部位。酶分子空間構(gòu)象的改變，可以在某些變性劑的作用下，破壞原有的空間構(gòu)象，然后在不同的物理條件下，酶分子重新構(gòu)建新的空間構(gòu)象。例如：胰蛋白酶用鹽酸胍處理，破壞蛋白質(zhì)的副鍵，肽鏈充分伸展，原有的空間構(gòu)象被破壞。然后，透析除去變性劑，再在不同的溫度條件下，使酶重新構(gòu)建新的空間構(gòu)象。結(jié)果表明，在20℃條件下，重新構(gòu)建的胰蛋白酶與天然胰蛋白酶的穩(wěn)定性基本相同；而在50℃條件下重新構(gòu)建的酶，穩(wěn)定性比天然酶提高5倍。

第八節(jié)酶的定向進化酶分子的合理設(shè)計(rationaldesign)酶分子的定向進化(directedevolution)酶的合理設(shè)計體外定向進化的意義理論上，蛋白質(zhì)分子蘊藏著很大的進化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進化的基本先決條件。所謂酶的體外定向進化，又稱實驗分子進化，屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機制，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進化機制(隨機突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。酶的體外定向進化技術(shù)極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計所不能解決的問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命力。定向進化的原理在待進化酶基因的PCR擴增反應(yīng)中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’->5’校對功能的性質(zhì)，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，構(gòu)建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。定向進化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進化=隨機突變+選擇。前者是人為引發(fā)的，后者雖相當(dāng)于環(huán)境，但只作用于突變后的分子群，起著選擇某一方向的進化而排除其他方向突變的作用，整個進化過程完全是在人為控制下進行的DNA改組和外顯子改組DNA改組（DNAshuffling）又稱有性PCR(sexualPCR)，原理。該策略的目的是創(chuàng)造將親本基因群中的突變盡可能組合的機會，導(dǎo)致更大的變異，最終獲取最佳突變組合的酶。通過DNA改組,不僅可加速積累有益突變，而且可使酶的2個或更多的已優(yōu)化性質(zhì)合為一體。外顯子改組（e