高效液相色譜分類及工作原理

關(guān)于高效液相色譜分類及工作原理第一頁，共五十頁，2022年，8月28日第一節(jié)高效液相色譜法概述第二頁，共五十頁，2022年，8月28日第三頁，共五十頁，2022年，8月28日第四頁，共五十頁，2022年，8月28日第五頁，共五十頁，2022年，8月28日一、理論基礎(chǔ)：速率理論A為渦流擴散項B/u分子擴散項Cu項即傳質(zhì)阻力項第六頁，共五十頁，2022年，8月28日二、HPLC技術(shù)

采用高壓輸液泵，高效微粒固定相和高靈敏度檢測器。三、HPLC特點高壓、高速、高效、高靈敏度、樣品回收方便。第七頁，共五十頁，2022年，8月28日㈠經(jīng)典LC與HPLC比較

經(jīng)典LCHPLC柱之內(nèi)徑1~5cm~0.4cm長度50~100cm15~50cm填充材料粒度150μm~200μm4μm~10μm使用壓力1~10atm50~200atm分離時間0.5h~天~10min第八頁，共五十頁，2022年，8月28日㈡與氣相色譜法比較，HPLC的優(yōu)點分析對象廣

氣相色譜只限于分析氣體和沸點較低的化合物；HPLC不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，適用于高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)。原則上講，幾乎可以分析除永久氣體外所有的有機和無機化合物。

第九頁，共五十頁，2022年，8月28日⒉流動相對分離起作用

氣相色譜的流動相僅起運載作用，對組分不產(chǎn)生相互作用力；HPLC的流動相對組分產(chǎn)生相互作用力，相當(dāng)于增加了一個控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)。第十頁，共五十頁，2022年，8月28日⒊經(jīng)常在室溫條件下操作

氣相色譜法一般在較高溫度下進(jìn)行缺點：儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴(yán)格。第十一頁，共五十頁，2022年，8月28日第二節(jié)HPLC的主要類型一、液一液分配色譜法（LLPC）

在液-液色譜中,流動相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。

第十二頁，共五十頁，2022年，8月28日1．分離原理液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。第十三頁，共五十頁，2022年，8月28日

2.固定相

液液色譜的固定相由載體和固定液組成。常用的載體有下列幾類：（1）全多孔型載體：由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑約100m的全多孔型顆粒。

這類固定相由于顆粒很細(xì)，孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。第十四頁，共五十頁，2022年，8月28日（2）表面多孔型載體（薄殼型微珠載體）：由直徑為30~40m的實心玻璃球和厚度約為1~2m的多孔性外層所組成。目前，這種載體粒度為5~10m。

這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達(dá)平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。第十五頁，共五十頁，2022年，8月28日⑶化學(xué)鍵合固定相：它是將各種不同有機基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機械涂漬，因此它的產(chǎn)生對液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以認(rèn)為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計，約有3/4以上的分離問題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。第十六頁，共五十頁，2022年，8月28日3．流動相

根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。正相分配色譜：流動相的極性小于固定相的極性，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。反相分配色譜：流動相的極性大于固定相的極性，它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反第十七頁，共五十頁，2022年，8月28日二、液一固吸附色譜法(LSAC)

液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進(jìn)行分離的。第十八頁，共五十頁，2022年，8月28日1．分離原理

當(dāng)流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當(dāng)試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保留就要取代數(shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇┓钟茫┯谑?，在固定相表面發(fā)生競爭吸附:

X+nSad=Xad+nS第十九頁，共五十頁，2022年，8月28日達(dá)平衡時,有其中Kad為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強，難于洗脫。Kad值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。Kad值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。第二十頁，共五十頁，2022年，8月28日2．固定相

液－固吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點較多，如線性容量較高，機械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多。目前最廣泛使用的還是5～10m的全多孔型微粒填料。第二十一頁，共五十頁，2022年，8月28日3.流動相

一般把吸附色譜中流動相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對極性大的試樣往往采用極性強的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。第二十二頁，共五十頁，2022年，8月28日三、離子交換色譜法（IEC）

此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。第二十三頁，共五十頁，2022年，8月28日1．離子交換原理

離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：第二十四頁，共五十頁，2022年，8月28日陽離子交換：陰離子交換：一般形式：R一A＋B＝R－B＋A第二十五頁，共五十頁，2022年，8月28日達(dá)平衡時，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）：式中[A]r，[B]r分別代表樹脂相中洗脫劑離子（A）和試樣離子（B）的濃度，[A]、[B]則代表它們在溶液中的濃度。

KB/A越大，說明B離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說來，B離子電荷越大，水合離子半徑越小，KB/A值就越大。第二十六頁，共五十頁，2022年，8月28日2.固定相（l）多孔型離子交換樹脂它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為5～20μm，有微孔型和大孔型之分。（2）薄膜型離子交換樹脂

它是在直徑約對30μm的固體惰性核上，凝聚1～2μm厚的樹脂層。（3）表面多孔型離子交換樹脂它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂。第二十七頁，共五十頁，2022年，8月28日（4）離子交換鍵合固定相它是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點是機械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實現(xiàn)快速分離。第二十八頁，共五十頁，2022年，8月28日3.流動相

離子交換色譜法所用流動相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強度）的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。

有時也使用有機溶劑如甲醇或乙醇同水緩沖溶液混合使用，以提高特殊的選擇性，并改善樣品的溶解度。第二十九頁，共五十頁，2022年，8月28日鹽離子的濃度影響：

如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。第三十頁，共五十頁，2022年，8月28日

要視不同情況而定。例如，分離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的pH值來控制。增大pH值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低PH值，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。pH值的影響：第三十一頁，共五十頁，2022年，8月28日四、離子對色譜法（IPC）

離子對色譜法是分離分析強極性有機酸和有機堿的極好方法。離子對色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法。第三十二頁，共五十頁，2022年，8月28日

由于離子對化合物A-B+具有疏水性，因而被非極性固定相（有機相）提取。組分離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對的能力大小不同以及形成的離子對流水性質(zhì)不同，導(dǎo)致各組分離子在固定相中滯留時間不同，因而出峰先后不同。這就是離子對色譜法分離的基本原理。第三十三頁，共五十頁，2022年，8月28日流動相：加有平衡離子（反離子）的極性溶液通過改變流動相的pH、平衡離子的濃度和種類可改變分離的選擇性。

固定相：非極性的疏水鍵合相第三十四頁，共五十頁，2022年，8月28日五、離子色譜法（IC）抑制型：抑制柱型、連續(xù)抑制型分離柱中離子交換樹脂的交換容量通常在0.01～0.05毫摩爾/克干樹脂非抑制型:

當(dāng)進(jìn)一步降低分離柱中樹脂的交換容量(0.007～0.07毫摩爾/克干樹脂),使用低濃度、低電離度的有機弱酸及弱酸鹽作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸鹽等。檢測器可直接與分離柱相連，不需抑制柱。⒈離子色譜裝置類型第三十五頁，共五十頁，2022年，8月28日

第三十六頁，共五十頁，2022年，8月28日⒉離子色譜連續(xù)抑制裝置圖：第三十七頁，共五十頁，2022年，8月28日

通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動相，從而用電導(dǎo)檢測器可直接檢測各種離子的含量。若樣品為陽離子，用無機酸作流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換劑。當(dāng)試樣經(jīng)陽離子交換劑的分離往后，隨流動相進(jìn)入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個重要反應(yīng)：第三十八頁，共五十頁，2022年，8月28日R+－OH＋H+Cl--→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl--→M+OH－＋R+－Cl-

由反應(yīng)可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動相本底電導(dǎo)的影響。同時，又將樣品陽離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的濃度為Cl-離子的2．6倍，提高了所測陽離子電導(dǎo)的檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有相似的作用機理。第三十九頁，共五十頁，2022年，8月28日⒊離子色譜的應(yīng)用：陰離子分析:雙柱：薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3×250mm),流動相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七種陰離子在20分鐘內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在3～50ppm。第四十頁，共五十頁，2022年，8月28日

第四十一頁，共五十頁，2022年，8月28日六、空間排阻色譜法（SEC）

主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。

第四十二頁，共五十頁，2022年，8月28日1.固定相

排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。

所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。第四十三頁，共五十頁，2022年，8月28日（1）軟性凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。（2）半剛性凝膠如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。（3）剛性凝膠如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性