孤啡肽對DGP胃動力的影響 5100字

孤啡肽對DGP胃動力的影響5100字【摘要】目的：探討糖尿病胃輕癱〔DGP〕大鼠血漿孤啡肽〔OFQ〕的變化與胃輕癱的關(guān)系及意義.研究孤啡肽對DGP胃排空的作用.辦法:SPF級雄性Wistar大鼠90只隨機(jī)分為正常對照組(n=15)和實驗組(n=75).正常對照組以普通飼料喂養(yǎng)20wk，實驗組以高脂高糖飼料喂養(yǎng)6wk后小劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射加高糖高脂飼料及飲食失節(jié)法繼續(xù)誘導(dǎo)20wk，建立糖尿病模型.應(yīng)用放射性核素胃排空法篩檢出DGP及糖尿病(DM)大鼠模型.采用酶聯(lián)免疫法測定空腹血漿OFQ，而后將DGP再隨機(jī)分為3組,分別給予OFQ0.6,6.0,60.0nmol/kg靜脈注射，每日1次,連續(xù)5d,再次測定胃排空.結(jié)果：正常對照組、DM組及DGP組胃半排空時間(GET1/2)分別為(61.9±4.6),(66.5±2.3),(168.9±10.6)min,DGP組GET1/2較正常對照組、DM組顯著延遲,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P【關(guān)鍵詞】孤啡肽；糖尿病并發(fā)癥；胃肌輕癱；胃排空；大鼠

0引言

糖尿病性胃輕癱〔diabeticgastroparesis，DGP)以胃腸動力缺乏為主要特征.目前臨床治療主要應(yīng)用促進(jìn)胃腸動力的藥物緩解病癥，療效欠佳.孤啡肽(OrphaninFQ,OFQ)或痛敏素(nociceptin)是一種具有拮抗嗎啡鎮(zhèn)痛作用的內(nèi)源性阿片肽類物質(zhì).有研究認(rèn)為OFQ是一種胃腸道內(nèi)的活性肽類物質(zhì)和胃腸功能的內(nèi)源性神經(jīng)調(diào)節(jié)劑［1］.對于OFQ的研究目前主要集中在減輕疼痛和其他生理活動中的作用，其胃腸功能調(diào)節(jié)的生物學(xué)效應(yīng)尚未完全闡明.研究DGP大鼠血漿OFQ的變化、OFQ對DGP大鼠胃排空的作用、以及OFQ劑量與胃排空的關(guān)系，將有助于拓寬胃腸動力紊亂的治療思路.

1材料和辦法

1.1材料SPF級雄性Wistar大鼠90只,體質(zhì)量(225±15)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF動物實驗中心提供；鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；血糖測定儀及試紙由強(qiáng)生公司提供；OFQELISA試劑盒為美國ADL公司的產(chǎn)品;MK《2酶標(biāo)儀JZW《I《20；OFQ由蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院人體與動物機(jī)能實驗室提供；同位素99mTc2二亞乙三胺五醋酸(DTPA)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院同位素研究所提供；以色列ElscintHelix公司的雙探頭單光子發(fā)射計算機(jī)斷層照相儀.

1.2辦法

1.2.1動物分組與實驗處理隨機(jī)選取15只大鼠作為正常對照組，該組以普通飼料喂養(yǎng).另75只為實驗組大鼠,以高脂高糖飼料〔100g/L豬油、200g/L白糖﹑25g/L膽固醇，10g/L膽酸鹽﹑665g/L常規(guī)飼料〕飼養(yǎng)，兩組誘導(dǎo)6wk后正常對照組經(jīng)腹腔注射等量枸櫞酸鈉緩沖液，實驗組經(jīng)腹腔注射枸櫞酸緩沖液配制的鏈脲佐菌素〔STZ〕(30mg/kg).72h后尾靜脈采血測定空腹血糖，以空腹血糖高于16.7mmol/L確定為糖尿病模型建立成功.有65只達(dá)標(biāo)，8只不達(dá)標(biāo)，造模過程中死亡2只.3d后補(bǔ)注STZ〔15mg/kg,ip〕，測定血糖2只達(dá)標(biāo)，6只不達(dá)標(biāo)剔除實驗.67只糖尿病大鼠造模成功后，不用胰島素和任何降糖藥物控制血糖.以高脂高糖飼料以及飲食失節(jié)法繼續(xù)飼養(yǎng)20wk，每周檢測血糖和體質(zhì)量，20wk后應(yīng)用放射性核素胃排空法，以正常對照組為正常范圍［2］，篩檢出DGP大鼠53只，將胃排空功能正常的大鼠設(shè)為糖尿病組〔n=14〕.隨機(jī)選取DGP大鼠〔n=16〕心臟采血,別離血漿,置-80℃超低溫冰箱保留，待測.殘余37DGP只大鼠，其中3只于尾靜脈注射過程中在固定器內(nèi)窒息死亡，殘余34只再隨機(jī)分為3組,分別給予OFQ0.6〔n=10),6.0(n=12).60.0nmol/kg(n=12)尾靜脈注射,連續(xù)5d，每日1次,第5日注射后再次進(jìn)行胃排空、體質(zhì)量及血糖測定.

1.2.2核素胃排空功能測定采用同位素閃爍計數(shù)法(APEXSP26,ElscintInc公司)檢測胃排空功能.大鼠禁食12h、禁水6h后，應(yīng)用含有同位素99mTc2DTPA標(biāo)記的蒙牛純牛奶大鼠腹部為目標(biāo)區(qū)〔窗寬20％，矩陣128×128，放大倍數(shù)3.0〕，行放射性活性1.5mL(99MTc《DTPA0.5mCi)，通過灌胃器遲緩注入胃內(nèi).之后立即將大鼠仰臥綁縛于特制固定架上，以采集.前半小時每5min采集1次，然后每15min采集1次，共采集11次，連續(xù)測定90min.通過隨機(jī)軟件，計算出各項指標(biāo)的校正值及胃的排空曲線.

1.2.3酶聯(lián)免疫法測定血漿OFQ大鼠空腹12h〔禁食不禁水〕后在吸入乙醚麻醉后對各組進(jìn)行心臟采血，血液置入預(yù)冷的含抑肽酶(500IU/L)和乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2，10g/L)的塑料指型管中，充沛混勻后，4℃，3000r/min，離心10min，留取血漿-80℃保留，統(tǒng)一采用ELISA辦法測定孤啡肽，各步驟嚴(yán)格按照表明書操作.

統(tǒng)計學(xué)處理：各組指標(biāo)用x±s表示,組間差別用方差分析,以P2結(jié)果

2.1大鼠體質(zhì)量正常對照組大鼠體質(zhì)量在實驗期間由(223±16)g增至(420±18)g，實驗組大鼠初始體質(zhì)量為(221±29)g,與正常對照組大鼠體質(zhì)量差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖1〕.造模前6wk實驗組大鼠體質(zhì)量增長迅速，經(jīng)STZ誘導(dǎo)為糖尿病模型20wk后,實驗組大鼠體質(zhì)量較成模前明顯下降(P0.05).

2.2大鼠血糖正常對照組大鼠的初始血糖為(5.7±0.6)mmol/L,20wk后為(7.1±0.5)mmol/L，前后差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).DM,DGP大鼠在腹腔注射STZ72h后其空腹血糖水平［(23.5±5.2),(22.9±4.3)mmol/L］較正常對照組大鼠顯著增高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05).

2.3胃半排空時間、胃內(nèi)核素殘留率正常對照組大鼠胃半排空時間(GET1/2)為(61.9±4.6)min，90min后胃內(nèi)核素殘留率為(46.4±3.6)%.以正常對照組為正常范圍,篩檢出DGP大鼠,DGP組大鼠GET1/2為(168.9±10.6)min,90min后胃內(nèi)核素殘留率為(85.6±2.9)%,均顯著延遲或高于正常對照組和DM組,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05〕.

DGP：糖尿病胃輕癱；DM：糖尿病.

圖13組大鼠體質(zhì)量的變化〔略〕

2.4血漿OFQ含量與胃半排空時間相關(guān)性分析正常對照組大鼠血漿OFQ與DM組比擬差別無統(tǒng)計學(xué)意義［(9.83士5.70)vs(8.90士3.50)ng/L,P>0.05)］.DGP組大鼠血漿OFQ［(5.30士1.70)ng/L］與DM組、正常對照組比擬差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P圖2血漿孤啡肽與胃半排空時間相關(guān)性〔略〕

2.5DGP大鼠在OFQ治療前后的胃半排空時間3組DGP大鼠給藥后GET1/2都較本組治療前顯著縮短,前后比擬差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05).

表13種劑量孤啡肽治療糖尿病胃輕癱大鼠胃半排空時間的比擬〔略〕

aP3討論

DGP的胃腸動力障礙，不僅影響患者食物的吸收和消化,還因影響口服藥物的吸收而給糖尿病的治療帶來極大的干擾.目前認(rèn)為可能是自主神經(jīng)功能障礙、胃腸激素分泌異常、高血糖、平滑肌損害以及微血管病變等因素綜合影響的結(jié)果.OFQ是一種新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)阿片肽,與經(jīng)典的阿片肽一樣屬于腦腸肽，作為一種胃腸道內(nèi)的活性肽類物質(zhì)，它是一種新的胃腸功能的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑［1］.許多學(xué)者證實OFQ與經(jīng)典的阿片肽一樣定位于大鼠的腸神經(jīng)系統(tǒng)，屬于腸神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，參與腸神經(jīng)系統(tǒng)對胃腸動力、內(nèi)分泌、粘膜血流及免疫功能的調(diào)節(jié)［3］.相對于胃腸道來講，腸神經(jīng)系統(tǒng)的作用要大于中樞神經(jīng)系統(tǒng).OFQ作為重要的腦腸肽之一,高度敘述于胃腸神經(jīng)系統(tǒng)而非平滑肌上［4］.Krowicki等［5-6］發(fā)現(xiàn)靜脈注入0.6～60.0nmol/kgOFQ可提高大鼠胃的收縮活性，提高胃內(nèi)壓.有研究檢測了健康人、肝硬化到肝癌患者的血漿OFQ水平,證實呈梯度升高趨勢，可為臨床診治肝臟腫瘤提供旁證［7］.另外血漿OFQ在肝豆?fàn)詈俗冃圆。?］、慢性膽囊炎、慢性胃炎及十二指腸球部潰瘍中皆升高，在急性胰腺炎呈現(xiàn)進(jìn)行性升高［9］.而在糖尿病胃動力障礙的長期慢性狀態(tài)下血漿OFQ水平的變化目前尚未見研究.本研究采用ELISA辦法測定血漿OFQ水平，發(fā)現(xiàn)DGP組明顯低于正常對照組和DM組,提示血漿OFQ水平在DGP時明顯下降.以上的結(jié)果表明可能由于長期糖尿病造成了微血管、胃腸肌間神經(jīng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞變性，導(dǎo)致肽能神經(jīng)受損［10］.使得定位于大鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)源性腸神經(jīng)遞質(zhì)之一的OFQ減少，由于DGP大鼠體內(nèi)不足促進(jìn)胃腸動力的內(nèi)源性神經(jīng)肽OFQ,導(dǎo)致OFQ促進(jìn)胃腸動力的作用減弱，從而引起DGP大鼠出現(xiàn)一系列胃腸動力障礙的胃腸道病癥.并且隨著血漿OFQ含量呈現(xiàn)下降趨勢，GET1/2的延遲時間呈現(xiàn)延長趨勢，相關(guān)性分析顯示血漿OFQ水平與GET1/2呈顯著負(fù)相關(guān),提示血漿OFQ的含量越下降，胃排空延遲時間越長，表明OFQ在DGP的發(fā)病中起著重要的調(diào)節(jié)作用.本研究靜脈給予0.6，6.0，60.0nmol/