第二十章常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用

常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第20章本章內(nèi)容分子雜交與印跡技術(shù)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用基因文庫(kù)生物芯片技術(shù)生物大分子相互研究技術(shù)第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)MolecularHybridizationandBlottingTechnique核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)

在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理復(fù)性RNADNA圖20-1核酸的分子雜交（一）印跡技術(shù)“blotting”，物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC)等各種膜上，成為固相化分子的技術(shù)。類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。（二）探針技術(shù)二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡(SouthernBlotting)（二）RNA印跡(NorthernBlotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡(WesternBlotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。(四)其他斑點(diǎn)印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點(diǎn)陣(DNAarray)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)圖20-2三種印跡技術(shù)的比較圖20-3分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③圖20－4放射自顯影照片第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用PrincipleandApplicationofPolymeraseChainReaction一、PCR技術(shù)的工作原理5Primer15Primer2Cycle2Cycle15555

5

5TemplateDNA55555555Cycle355

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525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。模板DNAdNTPs特異性引物耐熱DNA聚合酶Mg2+PCR體系基本組成成分變性95?C延伸72?C退火Tm-5?CPCR體系基本反應(yīng)步驟二、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克隆（二）基因突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測(cè)定（五）基因突變分析

RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對(duì)已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（二）原位PCR技術(shù)原位PCR(insituPCR)結(jié)合PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR)技術(shù)通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。實(shí)時(shí)PCR分類：實(shí)時(shí)PCR非探針類SYBRGreen熒光染料

探針類1.TaqMan探針法2.

分子信標(biāo)探針法3.FRET探針法圖20-5基于SYBRGreen染料法實(shí)時(shí)PCR技術(shù)圖20-6TaqMan探針法實(shí)時(shí)PCR原理示意圖第三節(jié)基因文庫(kù)GeneLibrary基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)基因文庫(kù)(genelibrary)是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。一、基因組DNA文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)：生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。載體:噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。cDNA文庫(kù)是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。二、cDNA文庫(kù)圖21-7基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選第四節(jié)生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnique也被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。將大量（通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于400)探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。一、基因芯片基因芯片(genechip)圖20-9基因芯片工作流程示意圖圖20-10

DNA芯片結(jié)果是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理第五節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)（一）標(biāo)簽蛋白沉淀應(yīng)用：證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。圖21-11標(biāo)簽融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程示意圖（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途圖21-12酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用證明生物信息學(xué)推測(cè)的蛋白質(zhì)相互作用。分析蛋白質(zhì)分子的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)（一）電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定(EMSA)凝膠遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)(gelshiftassay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。放射自顯影未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針標(biāo)記探針1X1X1X1X核蛋白提取物1X