第22章免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理

第22章免疫學(xué)檢測(cè)原理免疫學(xué)檢測(cè)是指借助免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論或方法，對(duì)抗原、抗體、免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子等進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。臨床醫(yī)學(xué)中，免疫學(xué)檢測(cè)可用于免疫相關(guān)疾病的診斷、病情檢測(cè)和療效評(píng)價(jià)等。第一節(jié)基于抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)方法第二節(jié)免疫細(xì)胞檢測(cè)第三節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)在免疫學(xué)上的應(yīng)用本章內(nèi)容第一節(jié)基于抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)方法一、抗原抗體反應(yīng)概念抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)、外發(fā)生的高度特異性結(jié)合反應(yīng)。在合適條件下所進(jìn)行的體外反應(yīng)中，抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合可呈現(xiàn)某種反應(yīng)現(xiàn)象（如凝集、沉淀）。由于實(shí)驗(yàn)所用抗體存在于血清中，故又稱血清學(xué)反應(yīng)。二、抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)高度特異性可精確區(qū)分物質(zhì)間極微細(xì)的差異。表示為親和力：一個(gè)抗原表位與相應(yīng)抗體單一抗原結(jié)合位點(diǎn)間的結(jié)合能力。親合力：指一個(gè)抗體分子與整個(gè)抗原大分子間的結(jié)合強(qiáng)度，與抗原表位數(shù)目有關(guān)。2.抗原抗體結(jié)合的帶現(xiàn)象與可見性抗原抗體結(jié)合存在帶現(xiàn)象（前帶、等帶、后帶），適宜的抗原抗體濃度和比例（等帶）決定抗原抗體結(jié)合后能否出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)；3.表面化學(xué)基團(tuán)之間的可逆結(jié)合抗原抗體結(jié)合除了空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)外，主要以氫鍵、范德華力和疏水鍵等非共價(jià)結(jié)合。易受溫度、酸堿度和離子強(qiáng)度的影響而解離，解離后抗原抗體仍具有原有特性，可借助親和層析法純化抗原或抗體?？乖贵w反應(yīng)的2個(gè)階段第1階段是抗原抗體特異性結(jié)合，可在數(shù)秒鐘至幾分鐘內(nèi)完成；第2階段是小的抗原抗體復(fù)合物靠正負(fù)電荷吸引形成較大復(fù)合物，所需時(shí)間從數(shù)分鐘至數(shù)日不等。三、抗原抗體反應(yīng)的影響因素電解質(zhì)抗原抗體等電點(diǎn)分別為pH3-5和pH5-6，在中性或弱堿性條件下表面帶有較多負(fù)電荷，適當(dāng)濃度的電解質(zhì)會(huì)使它們失去一部分負(fù)電荷而相互結(jié)合；溫度通常為37℃，適當(dāng)提高反應(yīng)溫度可增加抗原與抗體分子的碰撞機(jī)會(huì)，但56℃以上可使抗原或抗體變性失活；酸堿度抗原抗體反應(yīng)的最適pH值在6-8之間，pH值過高或過低均可直接影響抗原抗體的理化性質(zhì)。當(dāng)pH值接近等電點(diǎn)時(shí)，抗原抗體多帶正負(fù)電荷相等，由于自身吸引而出現(xiàn)凝集，導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。四、抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)、外發(fā)生的高度特異性結(jié)合反應(yīng)。在合適條件下所進(jìn)行的體外反應(yīng)中，抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合可呈現(xiàn)某種反應(yīng)現(xiàn)象（如凝集、沉淀）。由于實(shí)驗(yàn)所用抗體存在于血清中，故又稱血清學(xué)反應(yīng)。五、抗原-抗體反應(yīng)的基本檢測(cè)方法AbAg高親和力AbAg低親和力特異性結(jié)合力的表示方法親和力和親合力低親合力高親合力Ag-Ab反應(yīng)的原理Ab過剩Ag過剩比例適當(dāng)，交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)Ag-Ab反應(yīng)的可見性1.凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng)1:2稀釋待測(cè)血清1:41:81:16細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性Ag或表面包被抗原的顆粒狀物質(zhì)與相應(yīng)Ab在電解質(zhì)存在的情況下直接反應(yīng)，二者比例合適時(shí)，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團(tuán)現(xiàn)象。玻片法試管法常用于菌種鑒定或ABO血型鑒定選擇最佳稀釋濃度，常用于檢測(cè)抗體的滴度或效價(jià)，見于臨床診斷傷寒或副傷寒所用的肥達(dá)氏反應(yīng)和診斷布氏菌病所用的瑞特試驗(yàn)。間接凝集反應(yīng)將可溶性Ag/Ab先吸附在某些顆粒載體上，形成致敏顆粒，然后再與相應(yīng)Ab/Ag進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生凝集，叫間接凝集反應(yīng)。如將溶血毒素O吸附于乳膠顆粒上的抗“O”試驗(yàn)、人IgG作為Ag吸附于乳膠顆粒上的類風(fēng)濕因子檢測(cè)。凝集反應(yīng)常用于溶血性疾病的診斷：+YYYYYYYYYYYY病人的RBC體內(nèi)anti-Rh由于抗體多屬于IgG，分子量較小，抗體與紅細(xì)胞間的結(jié)合力不能克服細(xì)胞間的排斥力，不出現(xiàn)凝集+YYYYYYYYYYYYYYY體外加入抗人IgG出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫直接庫(kù)姆試驗(yàn)正常人O型血的Rh+的RBC+YYYY患者血清內(nèi)的游離anti-Rh+Y體外加入抗人IgGYYYYYYYYYYYYYY出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫間接庫(kù)姆試驗(yàn)2.沉淀反應(yīng)AgAgAgAgAbingel單向免疫擴(kuò)散Ag1AbAg2Ag3Ag4雙向免疫擴(kuò)散免疫比濁過量AbAbAbAb毒素、組織浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)后，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)可在液體中進(jìn)行，也可在半固體瓊脂凝膠中進(jìn)行。鑒定多種抗原是完全相同、部分相同或完全不同用于確定抗原濃度沉淀反應(yīng)—免疫電泳存在于不同區(qū)域的抗原與抗體結(jié)合，在比例適宜處形成沉淀弧。沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)比，可分析樣品的成分及其性質(zhì)。3.免疫標(biāo)記技術(shù)免疫酶測(cè)定法免疫熒光技術(shù)放射免疫測(cè)定法免疫膠體金技術(shù)①免疫酶測(cè)定法夾心法ELISA間接ELISABAS—ELISA利用生物素和抗生物素蛋白為橋梁微粒捕獲酶免疫分析技術(shù)將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物素、親和素、酶相結(jié)合，最后酶作用于熒光底物發(fā)光，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度判斷未知抗原的含量。a）b）免疫組化技術(shù)定位、定性、定量檢測(cè)②免疫熒光技術(shù)③放射免疫測(cè)定用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行的免疫測(cè)定。將同位素的敏感性與抗原抗體結(jié)合的特異性結(jié)合起來，具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于激素、藥物等微量物質(zhì)的檢測(cè)。常用的有131I、125I。④化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。最常用的發(fā)光物質(zhì)是魯米諾。靈敏度高、簡(jiǎn)便、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析。⑤免疫膠體金技術(shù)用膠體金顆粒標(biāo)記Ab/Ag，以檢測(cè)未知Ag/Ab的方法。氯金酸在還原劑作用下，可聚合成特定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。該技術(shù)可應(yīng)用于免疫組化(光鏡下檢查)和免疫層析快速診斷。⑥免疫印跡法-Westernblotting4.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)又稱為蛋白質(zhì)微列陣，指固定于支持介質(zhì)上的大量蛋白質(zhì)構(gòu)成的微列陣。根據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理，可實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測(cè)。第二節(jié)免疫細(xì)胞檢測(cè)淋巴細(xì)胞及其亞群的分離免疫細(xì)胞功能測(cè)定磁珠分離法免疫吸附分離法流式細(xì)胞術(shù)肽—MHC四聚體技術(shù)T細(xì)胞功能測(cè)定B細(xì)胞功能測(cè)定細(xì)胞因子檢測(cè)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測(cè)抗體含量測(cè)定溶血空斑試驗(yàn)巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)細(xì)胞毒試驗(yàn)吞噬功能測(cè)定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞染色法凋亡細(xì)胞檢測(cè)法硝基藍(lán)四氮唑試驗(yàn)生物活性檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法一、免疫細(xì)胞及其亞類計(jì)數(shù)稀釋血液淋巴細(xì)胞分離液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078)離心單個(gè)核細(xì)胞(PBMC，包括淋巴細(xì)胞、DC和NK)紅細(xì)胞和粒細(xì)胞血漿外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離稀釋血液淋巴細(xì)胞分離液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078)離心單個(gè)核細(xì)胞(PBMC，包括淋巴細(xì)胞、DC和NK)紅細(xì)胞和粒細(xì)胞血漿磁珠分離法免疫吸附分離法流式細(xì)胞術(shù)肽—MHC四聚體技術(shù)淋巴細(xì)胞及其亞群的分離免疫吸附分離法加入淋巴細(xì)胞懸液anti-CD4anti-CD4anti-CD4棄上清磁珠分離法流式細(xì)胞術(shù)熒光抗體標(biāo)記混合細(xì)胞噴嘴單細(xì)胞懸液5000-10000個(gè)/秒細(xì)胞分選器熒光檢測(cè)器抗原肽-MHC四聚體分離技術(shù)親和素抗原肽MHCI生物素anti-CD8肽-四聚體肽特異性CD8TCD4T及B非肽特異性CD8T熒光素二、免疫細(xì)胞功能的測(cè)定T細(xì)胞功能測(cè)定B細(xì)胞功能測(cè)定細(xì)胞因子檢測(cè)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測(cè)抗體含量測(cè)定溶血空斑試驗(yàn)巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)細(xì)胞毒試驗(yàn)吞噬功能測(cè)定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞染色法凋亡細(xì)胞檢測(cè)法硝基藍(lán)四氮唑試驗(yàn)生物活性檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法T細(xì)胞功能測(cè)定T細(xì)胞增殖試驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測(cè)T細(xì)胞受到特異性抗原或有絲分裂原刺激后發(fā)生增殖，可通過以下三種方法檢測(cè)：形態(tài)計(jì)數(shù)法：活化細(xì)胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則、胞質(zhì)增多、細(xì)胞核松散及出現(xiàn)較多核仁；3H-TdR或125I-UdR摻入法：3H-TdR能摻入到合成的DNA中，用液體閃爍儀檢測(cè)樣品的放射活性，特點(diǎn)是靈敏可靠，但須特殊儀器，易有放射性污染。MTT(四甲基偶氮唑鹽)比色法：外來抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答后，再用相同的抗原作皮試，可導(dǎo)致遲發(fā)型超敏反應(yīng)，T細(xì)胞活化并釋放多種細(xì)胞因子，產(chǎn)生以單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥，局部發(fā)生充血滲出，24-48h發(fā)生，72h到達(dá)高峰。陽性反應(yīng)表現(xiàn)為局部紅腫和硬結(jié)，反應(yīng)強(qiáng)烈的發(fā)生水腫甚至壞死。細(xì)胞免疫正常者出現(xiàn)陽性反應(yīng)，細(xì)胞免疫低下者呈弱陽性或陰性反應(yīng)。常用于檢測(cè)某些微生物感染。B細(xì)胞功能測(cè)定抗體含量測(cè)定溶血空斑試驗(yàn)可通過單項(xiàng)瓊脂擴(kuò)散法、ELISA、速率比濁法等測(cè)定標(biāo)本中各類Ig的含量。綿羊紅細(xì)胞(SRBC)免疫動(dòng)物4天后取出動(dòng)物脾臟，在脾細(xì)胞懸液中含有抗SRBC的漿細(xì)胞脾細(xì)胞與SRBC在適量瓊脂糖液中混勻在抗體形成細(xì)胞周圍出現(xiàn)溶解的透明區(qū)，即溶血空斑。1個(gè)空斑區(qū)代表1個(gè)漿細(xì)胞通過記錄溶血空斑的數(shù)目可知抗原特異性B細(xì)胞的數(shù)目加入新鮮補(bǔ)體，倒入平皿中培養(yǎng)細(xì)胞毒試驗(yàn)51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞染色法靶細(xì)胞被殺傷后，向體系中加入臺(tái)盼蘭，可進(jìn)入膜破損的細(xì)胞內(nèi)，將細(xì)胞染成藍(lán)色?；罴?xì)胞拒染而不著色。凋亡細(xì)胞檢測(cè)法瓊脂糖電泳法正常細(xì)胞基因組DNA凋亡細(xì)胞TUNEL法在細(xì)胞中加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)和生物素標(biāo)記的核苷酸TdT能在游離的DNA3’端缺口連接標(biāo)記的核苷酸加入親和素-酶復(fù)合物，在DNA斷裂處顯色流式細(xì)胞術(shù)AnnexinVPI凋亡早期凋亡晚期壞死期巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)吞噬功能測(cè)定硝基藍(lán)四氮唑(NBT)試驗(yàn)NBT在殺菌過程中產(chǎn)生反應(yīng)性氧中間物，其中超氧陰離子能使被吞噬進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的NBT還原成不溶性藍(lán)黑色甲臜顆粒，沉積于胞漿中。光鏡下計(jì)數(shù)NBT陽性細(xì)胞可反映PMN的殺傷功能。將待測(cè)mf與雞紅細(xì)胞混合溫育后，雞紅細(xì)胞被mf吞噬，根據(jù)吞噬百分率確定mf吞噬能力。吞噬百分率=吞有紅細(xì)胞的mf/mf總數(shù)細(xì)胞因子檢測(cè)生物活性檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法夾心ELISA或ELISPOT熒光素標(biāo)記抗體染胞內(nèi)細(xì)胞因子，F(xiàn)ACS分析細(xì)胞增殖或增殖抑制法，如細(xì)胞因子依賴性或抑制性細(xì)胞株細(xì)胞病變抑制法，如感干擾素抑制病毒感染性細(xì)胞損傷檢測(cè)B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體檢測(cè)T細(xì)胞產(chǎn)生的CK酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)-ELISpot

對(duì)血細(xì)胞惡性變?nèi)绨籽?、淋巴瘤等的診斷，長(zhǎng)期以來多應(yīng)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查和免疫細(xì)胞表型分析。由于這些方法在特異性和敏感性上的限制，對(duì)于丟失了細(xì)胞表面標(biāo)志，或分化較好難以和正常細(xì)胞區(qū)別。也可能由于惡性細(xì)胞數(shù)量少，混在大量正常細(xì)胞中難以查出。第三節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)在免疫學(xué)上的應(yīng)用一、BCR和TCR基因重排檢測(cè)

利用分子生物學(xué)，獲得Ig片段的特異基因克隆及TCR各鏈的基因克隆，分別應(yīng)用Ig基因和TCR基因重排作為B細(xì)胞和T細(xì)胞的特異標(biāo)記，分別診斷B細(xì)胞來源和T細(xì)胞惡性病變引起的白血病。具體操作：從待檢的細(xì)胞中分離出總DNA。非T、非B細(xì)胞的Ig和TCR基因不發(fā)生重排，稱為胚基因。而T和B細(xì)胞在分化早期即有TCR和Ig基因重排，重排后的Ig和TCR片段，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜或尼龍膜上，然后用同位素或酶標(biāo)記的Ig血病細(xì)胞進(jìn)行分類鑒定。若有Ig基因重排說明惡性細(xì)胞來源于B細(xì)胞，若有TCR基因發(fā)生重排，則為T細(xì)胞來源的。如果既無Ig基因重排，又無TCR基因重排的淋巴細(xì)胞則屬非T、非B細(xì)胞來源的瘤細(xì)胞。總DNA胚基因TCR和Ig基因硝酸纖維膜同位素鑒定Ig基因重排TCR基因重排無重排B細(xì)胞來源T細(xì)胞來源其他細(xì)胞來源二、限制酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性