第22章免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理_第1頁
第22章免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理_第2頁
第22章免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理_第3頁
第22章免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理_第4頁
第22章免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理_第5頁
已閱讀5頁,還剩39頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

第22章免疫學(xué)檢測(cè)原理免疫學(xué)檢測(cè)是指借助免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論或方法,對(duì)抗原、抗體、免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子等進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。臨床醫(yī)學(xué)中,免疫學(xué)檢測(cè)可用于免疫相關(guān)疾病的診斷、病情檢測(cè)和療效評(píng)價(jià)等。第一節(jié)基于抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)方法第二節(jié)免疫細(xì)胞檢測(cè)第三節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)在免疫學(xué)上的應(yīng)用本章內(nèi)容第一節(jié)基于抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)方法一、抗原抗體反應(yīng)概念抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)、外發(fā)生的高度特異性結(jié)合反應(yīng)。在合適條件下所進(jìn)行的體外反應(yīng)中,抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合可呈現(xiàn)某種反應(yīng)現(xiàn)象(如凝集、沉淀)。由于實(shí)驗(yàn)所用抗體存在于血清中,故又稱血清學(xué)反應(yīng)。二、抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)高度特異性可精確區(qū)分物質(zhì)間極微細(xì)的差異。表示為親和力:一個(gè)抗原表位與相應(yīng)抗體單一抗原結(jié)合位點(diǎn)間的結(jié)合能力。親合力:指一個(gè)抗體分子與整個(gè)抗原大分子間的結(jié)合強(qiáng)度,與抗原表位數(shù)目有關(guān)。2.抗原抗體結(jié)合的帶現(xiàn)象與可見性抗原抗體結(jié)合存在帶現(xiàn)象(前帶、等帶、后帶),適宜的抗原抗體濃度和比例(等帶)決定抗原抗體結(jié)合后能否出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng);3.表面化學(xué)基團(tuán)之間的可逆結(jié)合抗原抗體結(jié)合除了空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)外,主要以氫鍵、范德華力和疏水鍵等非共價(jià)結(jié)合。易受溫度、酸堿度和離子強(qiáng)度的影響而解離,解離后抗原抗體仍具有原有特性,可借助親和層析法純化抗原或抗體??乖贵w反應(yīng)的2個(gè)階段第1階段是抗原抗體特異性結(jié)合,可在數(shù)秒鐘至幾分鐘內(nèi)完成;第2階段是小的抗原抗體復(fù)合物靠正負(fù)電荷吸引形成較大復(fù)合物,所需時(shí)間從數(shù)分鐘至數(shù)日不等。三、抗原抗體反應(yīng)的影響因素電解質(zhì)抗原抗體等電點(diǎn)分別為pH3-5和pH5-6,在中性或弱堿性條件下表面帶有較多負(fù)電荷,適當(dāng)濃度的電解質(zhì)會(huì)使它們失去一部分負(fù)電荷而相互結(jié)合;溫度通常為37℃,適當(dāng)提高反應(yīng)溫度可增加抗原與抗體分子的碰撞機(jī)會(huì),但56℃以上可使抗原或抗體變性失活;酸堿度抗原抗體反應(yīng)的最適pH值在6-8之間,pH值過高或過低均可直接影響抗原抗體的理化性質(zhì)。當(dāng)pH值接近等電點(diǎn)時(shí),抗原抗體多帶正負(fù)電荷相等,由于自身吸引而出現(xiàn)凝集,導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。四、抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)、外發(fā)生的高度特異性結(jié)合反應(yīng)。在合適條件下所進(jìn)行的體外反應(yīng)中,抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合可呈現(xiàn)某種反應(yīng)現(xiàn)象(如凝集、沉淀)。由于實(shí)驗(yàn)所用抗體存在于血清中,故又稱血清學(xué)反應(yīng)。五、抗原-抗體反應(yīng)的基本檢測(cè)方法AbAg高親和力AbAg低親和力特異性結(jié)合力的表示方法親和力和親合力低親合力高親合力Ag-Ab反應(yīng)的原理Ab過剩Ag過剩比例適當(dāng),交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)Ag-Ab反應(yīng)的可見性1.凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng)1:2稀釋待測(cè)血清1:41:81:16細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性Ag或表面包被抗原的顆粒狀物質(zhì)與相應(yīng)Ab在電解質(zhì)存在的情況下直接反應(yīng),二者比例合適時(shí),出現(xiàn)肉眼可見的凝集團(tuán)現(xiàn)象。玻片法試管法常用于菌種鑒定或ABO血型鑒定選擇最佳稀釋濃度,常用于檢測(cè)抗體的滴度或效價(jià),見于臨床診斷傷寒或副傷寒所用的肥達(dá)氏反應(yīng)和診斷布氏菌病所用的瑞特試驗(yàn)。間接凝集反應(yīng)將可溶性Ag/Ab先吸附在某些顆粒載體上,形成致敏顆粒,然后再與相應(yīng)Ab/Ag進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生凝集,叫間接凝集反應(yīng)。如將溶血毒素O吸附于乳膠顆粒上的抗“O”試驗(yàn)、人IgG作為Ag吸附于乳膠顆粒上的類風(fēng)濕因子檢測(cè)。凝集反應(yīng)常用于溶血性疾病的診斷:+YYYYYYYYYYYY病人的RBC體內(nèi)anti-Rh由于抗體多屬于IgG,分子量較小,抗體與紅細(xì)胞間的結(jié)合力不能克服細(xì)胞間的排斥力,不出現(xiàn)凝集+YYYYYYYYYYYYYYY體外加入抗人IgG出現(xiàn)凝集現(xiàn)象,叫直接庫(kù)姆試驗(yàn)正常人O型血的Rh+的RBC+YYYY患者血清內(nèi)的游離anti-Rh+Y體外加入抗人IgGYYYYYYYYYYYYYY出現(xiàn)凝集現(xiàn)象,叫間接庫(kù)姆試驗(yàn)2.沉淀反應(yīng)AgAgAgAgAbingel單向免疫擴(kuò)散Ag1AbAg2Ag3Ag4雙向免疫擴(kuò)散免疫比濁過量AbAbAbAb毒素、組織浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)后,出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物,稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)可在液體中進(jìn)行,也可在半固體瓊脂凝膠中進(jìn)行。鑒定多種抗原是完全相同、部分相同或完全不同用于確定抗原濃度沉淀反應(yīng)—免疫電泳存在于不同區(qū)域的抗原與抗體結(jié)合,在比例適宜處形成沉淀弧。沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)比,可分析樣品的成分及其性質(zhì)。3.免疫標(biāo)記技術(shù)免疫酶測(cè)定法免疫熒光技術(shù)放射免疫測(cè)定法免疫膠體金技術(shù)①免疫酶測(cè)定法夾心法ELISA間接ELISABAS—ELISA利用生物素和抗生物素蛋白為橋梁微粒捕獲酶免疫分析技術(shù)將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物素、親和素、酶相結(jié)合,最后酶作用于熒光底物發(fā)光,通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度判斷未知抗原的含量。a)b)免疫組化技術(shù)定位、定性、定量檢測(cè)②免疫熒光技術(shù)③放射免疫測(cè)定用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行的免疫測(cè)定。將同位素的敏感性與抗原抗體結(jié)合的特異性結(jié)合起來,具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于激素、藥物等微量物質(zhì)的檢測(cè)。常用的有131I、125I。④化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。最常用的發(fā)光物質(zhì)是魯米諾。靈敏度高、簡(jiǎn)便、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析。⑤免疫膠體金技術(shù)用膠體金顆粒標(biāo)記Ab/Ag,以檢測(cè)未知Ag/Ab的方法。氯金酸在還原劑作用下,可聚合成特定大小的金顆粒,形成帶負(fù)電的疏水膠溶液,因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。該技術(shù)可應(yīng)用于免疫組化(光鏡下檢查)和免疫層析快速診斷。⑥免疫印跡法-Westernblotting4.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)又稱為蛋白質(zhì)微列陣,指固定于支持介質(zhì)上的大量蛋白質(zhì)構(gòu)成的微列陣。根據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理,可實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測(cè)。第二節(jié)免疫細(xì)胞檢測(cè)淋巴細(xì)胞及其亞群的分離免疫細(xì)胞功能測(cè)定磁珠分離法免疫吸附分離法流式細(xì)胞術(shù)肽—MHC四聚體技術(shù)T細(xì)胞功能測(cè)定B細(xì)胞功能測(cè)定細(xì)胞因子檢測(cè)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測(cè)抗體含量測(cè)定溶血空斑試驗(yàn)巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)細(xì)胞毒試驗(yàn)吞噬功能測(cè)定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞染色法凋亡細(xì)胞檢測(cè)法硝基藍(lán)四氮唑試驗(yàn)生物活性檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法一、免疫細(xì)胞及其亞類計(jì)數(shù)稀釋血液淋巴細(xì)胞分離液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078)離心單個(gè)核細(xì)胞(PBMC,包括淋巴細(xì)胞、DC和NK)紅細(xì)胞和粒細(xì)胞血漿外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離稀釋血液淋巴細(xì)胞分離液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078)離心單個(gè)核細(xì)胞(PBMC,包括淋巴細(xì)胞、DC和NK)紅細(xì)胞和粒細(xì)胞血漿磁珠分離法免疫吸附分離法流式細(xì)胞術(shù)肽—MHC四聚體技術(shù)淋巴細(xì)胞及其亞群的分離免疫吸附分離法加入淋巴細(xì)胞懸液anti-CD4anti-CD4anti-CD4棄上清磁珠分離法流式細(xì)胞術(shù)熒光抗體標(biāo)記混合細(xì)胞噴嘴單細(xì)胞懸液5000-10000個(gè)/秒細(xì)胞分選器熒光檢測(cè)器抗原肽-MHC四聚體分離技術(shù)親和素抗原肽MHCI生物素anti-CD8肽-四聚體肽特異性CD8TCD4T及B非肽特異性CD8T熒光素二、免疫細(xì)胞功能的測(cè)定T細(xì)胞功能測(cè)定B細(xì)胞功能測(cè)定細(xì)胞因子檢測(cè)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測(cè)抗體含量測(cè)定溶血空斑試驗(yàn)巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)細(xì)胞毒試驗(yàn)吞噬功能測(cè)定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞染色法凋亡細(xì)胞檢測(cè)法硝基藍(lán)四氮唑試驗(yàn)生物活性檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法T細(xì)胞功能測(cè)定T細(xì)胞增殖試驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測(cè)T細(xì)胞受到特異性抗原或有絲分裂原刺激后發(fā)生增殖,可通過以下三種方法檢測(cè):形態(tài)計(jì)數(shù)法:活化細(xì)胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則、胞質(zhì)增多、細(xì)胞核松散及出現(xiàn)較多核仁;3H-TdR或125I-UdR摻入法:3H-TdR能摻入到合成的DNA中,用液體閃爍儀檢測(cè)樣品的放射活性,特點(diǎn)是靈敏可靠,但須特殊儀器,易有放射性污染。MTT(四甲基偶氮唑鹽)比色法:外來抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答后,再用相同的抗原作皮試,可導(dǎo)致遲發(fā)型超敏反應(yīng),T細(xì)胞活化并釋放多種細(xì)胞因子,產(chǎn)生以單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥,局部發(fā)生充血滲出,24-48h發(fā)生,72h到達(dá)高峰。陽性反應(yīng)表現(xiàn)為局部紅腫和硬結(jié),反應(yīng)強(qiáng)烈的發(fā)生水腫甚至壞死。細(xì)胞免疫正常者出現(xiàn)陽性反應(yīng),細(xì)胞免疫低下者呈弱陽性或陰性反應(yīng)。常用于檢測(cè)某些微生物感染。B細(xì)胞功能測(cè)定抗體含量測(cè)定溶血空斑試驗(yàn)可通過單項(xiàng)瓊脂擴(kuò)散法、ELISA、速率比濁法等測(cè)定標(biāo)本中各類Ig的含量。綿羊紅細(xì)胞(SRBC)免疫動(dòng)物4天后取出動(dòng)物脾臟,在脾細(xì)胞懸液中含有抗SRBC的漿細(xì)胞脾細(xì)胞與SRBC在適量瓊脂糖液中混勻在抗體形成細(xì)胞周圍出現(xiàn)溶解的透明區(qū),即溶血空斑。1個(gè)空斑區(qū)代表1個(gè)漿細(xì)胞通過記錄溶血空斑的數(shù)目可知抗原特異性B細(xì)胞的數(shù)目加入新鮮補(bǔ)體,倒入平皿中培養(yǎng)細(xì)胞毒試驗(yàn)51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞染色法靶細(xì)胞被殺傷后,向體系中加入臺(tái)盼蘭,可進(jìn)入膜破損的細(xì)胞內(nèi),將細(xì)胞染成藍(lán)色?;罴?xì)胞拒染而不著色。凋亡細(xì)胞檢測(cè)法瓊脂糖電泳法正常細(xì)胞基因組DNA凋亡細(xì)胞TUNEL法在細(xì)胞中加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)和生物素標(biāo)記的核苷酸TdT能在游離的DNA3’端缺口連接標(biāo)記的核苷酸加入親和素-酶復(fù)合物,在DNA斷裂處顯色流式細(xì)胞術(shù)AnnexinVPI凋亡早期凋亡晚期壞死期巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)吞噬功能測(cè)定硝基藍(lán)四氮唑(NBT)試驗(yàn)NBT在殺菌過程中產(chǎn)生反應(yīng)性氧中間物,其中超氧陰離子能使被吞噬進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的NBT還原成不溶性藍(lán)黑色甲臜顆粒,沉積于胞漿中。光鏡下計(jì)數(shù)NBT陽性細(xì)胞可反映PMN的殺傷功能。將待測(cè)mf與雞紅細(xì)胞混合溫育后,雞紅細(xì)胞被mf吞噬,根據(jù)吞噬百分率確定mf吞噬能力。吞噬百分率=吞有紅細(xì)胞的mf/mf總數(shù)細(xì)胞因子檢測(cè)生物活性檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法夾心ELISA或ELISPOT熒光素標(biāo)記抗體染胞內(nèi)細(xì)胞因子,F(xiàn)ACS分析細(xì)胞增殖或增殖抑制法,如細(xì)胞因子依賴性或抑制性細(xì)胞株細(xì)胞病變抑制法,如感干擾素抑制病毒感染性細(xì)胞損傷檢測(cè)B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體檢測(cè)T細(xì)胞產(chǎn)生的CK酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)-ELISpot

對(duì)血細(xì)胞惡性變?nèi)绨籽?、淋巴瘤等的診斷,長(zhǎng)期以來多應(yīng)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查和免疫細(xì)胞表型分析。由于這些方法在特異性和敏感性上的限制,對(duì)于丟失了細(xì)胞表面標(biāo)志,或分化較好難以和正常細(xì)胞區(qū)別。也可能由于惡性細(xì)胞數(shù)量少,混在大量正常細(xì)胞中難以查出。第三節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)在免疫學(xué)上的應(yīng)用一、BCR和TCR基因重排檢測(cè)

利用分子生物學(xué),獲得Ig片段的特異基因克隆及TCR各鏈的基因克隆,分別應(yīng)用Ig基因和TCR基因重排作為B細(xì)胞和T細(xì)胞的特異標(biāo)記,分別診斷B細(xì)胞來源和T細(xì)胞惡性病變引起的白血病。具體操作:從待檢的細(xì)胞中分離出總DNA。非T、非B細(xì)胞的Ig和TCR基因不發(fā)生重排,稱為胚基因。而T和B細(xì)胞在分化早期即有TCR和Ig基因重排,重排后的Ig和TCR片段,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜或尼龍膜上,然后用同位素或酶標(biāo)記的Ig血病細(xì)胞進(jìn)行分類鑒定。若有Ig基因重排說明惡性細(xì)胞來源于B細(xì)胞,若有TCR基因發(fā)生重排,則為T細(xì)胞來源的。如果既無Ig基因重排,又無TCR基因重排的淋巴細(xì)胞則屬非T、非B細(xì)胞來源的瘤細(xì)胞。總DNA胚基因TCR和Ig基因硝酸纖維膜同位素鑒定Ig基因重排TCR基因重排無重排B細(xì)胞來源T細(xì)胞來源其他細(xì)胞來源二、限制酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論