微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)

微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)第一頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日

胞外產(chǎn)品：各種胞外酶、胞外多糖、細(xì)胞代謝物細(xì)胞本身：?jiǎn)渭?xì)胞蛋白（SCP）胞內(nèi)產(chǎn)品:堿性磷酸酯酶，基因工程產(chǎn)物，植物細(xì)胞產(chǎn)物等1.微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)概述第二頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日2.細(xì)胞壁的組成和破碎阻力細(xì)菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力來(lái)自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)，主要阻力來(lái)自于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和厚度。絲狀真菌：多糖，蛋白質(zhì)，脂類，葡聚糖，幾丁質(zhì)，主要阻力來(lái)自于壁強(qiáng)度和聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。第三頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日第四頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日第五頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日第六頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日第七頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成

第八頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日3.微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)

第九頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日高壓勻漿法高壓勻漿器采用高壓勻漿器是大規(guī)模破碎細(xì)胞的常用方法，利用高壓迫使細(xì)胞懸浮液通過(guò)針形閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)造成細(xì)胞破裂第十頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日高壓勻漿法特點(diǎn)破碎率較高適合大規(guī)模細(xì)胞破碎碎片細(xì)小，胞內(nèi)物質(zhì)釋放完全適合格蘭氏陽(yáng)性菌和酵母的破碎;不適合霉菌,因?yàn)槿菀自斐啥氯?對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌破碎效果較差第十一頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日影響因素操作壓力（50～70MPa）細(xì)胞濃度（20％）溫度循環(huán)次數(shù)(2~5)第十二頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日高壓勻漿器第十三頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日第十四頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日珠磨法

珠磨法是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，使達(dá)到細(xì)胞的某種程度破碎。這些裝置的主要缺點(diǎn)是在破碎期間樣品溫度迅速升高，通過(guò)用二氧化碳來(lái)冷卻容器可得到部分解決。第十五頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日高速珠磨機(jī)第十六頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日珠磨法特點(diǎn)破碎率較高適合大規(guī)模細(xì)胞破碎碎片較小，胞內(nèi)物質(zhì)釋放完全溫度容易急劇上升，需要良好的降溫配套設(shè)備相對(duì)與酵母和細(xì)菌，珠磨法更適合真菌菌絲和藻類第十七頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日影響細(xì)胞破碎的因素?cái)嚢杷俣龋?00～1450r/min）料液的循環(huán)速度（50～500L/h）細(xì)胞濃度（0.3～0.5g/mL）珠粒大小和填充量（0.45～1mm；70％～90％)第十八頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日超聲波法細(xì)胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，從而產(chǎn)生一個(gè)極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質(zhì)中的懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，從而使細(xì)胞破碎。影響因素:功率、發(fā)射時(shí)間、次數(shù)、細(xì)胞懸浮液體積對(duì)于不同菌種的發(fā)酵液、超聲波處理的效果不同，桿菌比球菌易破碎、革蘭氏陰性菌細(xì)胞比革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞容易破碎，對(duì)酵母菌的效果極差。該法不適于大規(guī)模操作，因?yàn)榉糯蠛?，要輸入很高的能量?lái)提供必要的冷卻，這是困難的。第十九頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日電聲超聲波發(fā)生器第二十頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日

化學(xué)法

第二十一頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日

化學(xué)法采用化學(xué)法處理可以溶解細(xì)胞或抽提胞內(nèi)組分。常用酸、堿、表面活性劑和有機(jī)溶劑等化學(xué)試劑酸使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用6mol/LHCl。堿和表面活性劑能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來(lái)。常用表面活性劑有膽酸鹽、磷脂、SDS、CTAB、有機(jī)溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等

第二十二頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日化學(xué)法優(yōu)點(diǎn)：對(duì)產(chǎn)物的釋出選擇性好，細(xì)胞外形較完整，碎片少，核酸等胞內(nèi)雜質(zhì)釋放少，便于后步分離、不需要專門(mén)設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，故使用較多。缺點(diǎn)：易導(dǎo)致活性物質(zhì)破壞、化學(xué)試劑的加入，常會(huì)給隨后產(chǎn)物的純化帶來(lái)困難總結(jié)：①酸堿容易造成產(chǎn)物水解或變性，慎用；②表面活性劑以及丁酯、丁醇、丙酮等有機(jī)溶劑適合于絕大部分非蛋白類的物質(zhì)；

第二十三頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日

酶解法利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上特殊的鍵，從而達(dá)到破壁的目的。優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)，發(fā)生酶解的條件溫和。缺點(diǎn)：酶水解費(fèi)用較貴，一般只適用于小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室研究。溶菌酶是應(yīng)用最多的酶，它能專一地分解細(xì)胞壁上糖蛋白分子的α-1，4糖苷鍵，使脂多糖解離，經(jīng)溶菌酶處理后的細(xì)胞移至低滲溶液中使細(xì)胞破裂。第二十四頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中(如一定濃度的甘油或蔗糖溶液)，達(dá)到平衡后，介質(zhì)被突然稀釋，或者將細(xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞壁的破裂。滲透壓沖擊的方法僅對(duì)細(xì)胞壁較脆弱的菌，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理，或合成受抑制而強(qiáng)度減弱時(shí)才是合適的。第二十五頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日凍結(jié)-融化法將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍和室溫下融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。對(duì)于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。但通常破碎率很低即使反復(fù)循環(huán)多次也不能提高收率。另外，還可能引起對(duì)凍融敏感的某些蛋白質(zhì)的變性。第二十六頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日干燥法可采用空氣干燥，真空干燥，噴霧干燥和冷凍干燥等?？諝飧稍镏饕m用于酵母菌。真空干燥適用于細(xì)菌的干燥。冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)。干燥法條件變化較劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其它組織變性。第二十七頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日機(jī)械破碎法與非機(jī)械法比較

第二十八頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日4破碎方法的選擇細(xì)胞的量破碎條件——目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)破碎條件的敏感性破碎目標(biāo)——待破碎細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度第二十九頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日破碎率的測(cè)定1.直接測(cè)定法2.測(cè)定釋放的蛋白質(zhì)量或酶的活力或相對(duì)電導(dǎo)率第三十頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日破碎技術(shù)的新進(jìn)展①多種破碎方法相結(jié)合：凍融法與勻漿法結(jié)合破碎酵母，有效提高破碎率②與上游過(guò)程相結(jié)合：利用病毒進(jìn)行裂解溶胞③將細(xì)胞破碎與后續(xù)分離結(jié)合：珠磨法與雙水相萃取第三十一頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日5.基因工程表達(dá)產(chǎn)物的后處理

——包含體的分離與