現(xiàn)代生物實驗技術(shù)培訓(xùn)課件培訓(xùn)講學(xué)

現(xiàn)代生物實驗技術(shù)培訓(xùn)課件

醫(yī)學(xué)實驗中心管理制度1：可以申請使用大型儀器的補貼；大型儀器的使用需要提前預(yù)約；2：冰箱管理制度：免費使用低溫冰箱；普通冰箱三個月清理一次；3：門禁制度：采用刷卡制；4：其他：技術(shù)服務(wù)；資料室的網(wǎng)絡(luò)使用；投訴信箱等。第一章免疫組化技術(shù)主要內(nèi)容理論基礎(chǔ)1操作流程及基本技術(shù)2常見問題3基礎(chǔ)理論理論基礎(chǔ)是基于利用放射性核素和其他標(biāo)記物（熒光素，酶，重金屬離子等）作為示蹤劑，通過免疫親和（抗原-抗體特異性結(jié)合）和核酸雜交（堿基配對特異性連接）途徑，在組織切片或細(xì)胞涂片上，原位顯示生物大分子的動態(tài)變化而建立的一門染色技術(shù)。基本技術(shù)免疫酶組化技術(shù)免疫熒光技術(shù)示蹤的兩大技術(shù)實驗流程組織材料的制備

細(xì)胞玻片的制備石蠟切片冰凍切片細(xì)胞爬片細(xì)胞滴片DAB顯色操作流程抗原修復(fù)內(nèi)源性過氧化物抑制正常血清封閉第一抗體酶標(biāo)記抗體第二抗體以免疫酶組化為例結(jié)果分析免疫酶組化結(jié)果

圖像分析熒光顯微鏡免疫熒光結(jié)果激光共聚焦顯微鏡常見問題

組織或細(xì)胞脫片抗原修復(fù)時間，方式一抗稀釋度DAB顯色非特異性背景

免疫組化照片兔股骨頭BMP-2染色（復(fù)染后）人肝癌HepG2細(xì)胞P42染色人乳腺癌HeLa細(xì)胞P42熒光染色第二章激光捕獲顯微切割基本內(nèi)容激光捕獲顯微切割的應(yīng)用3激光捕獲顯微切割的原理2激光捕獲顯微切割的發(fā)展歷史1激光捕獲顯微切割的優(yōu)點4

激光捕獲顯微切割的發(fā)展歷史激光捕獲顯微切割(lasercapturemicrodissection,LCM)是一項在顯微鏡直視下，快速從組織切片中分離，純化單一類型細(xì)胞群或單個細(xì)胞的技術(shù)。手工（mannual)顯微切割顯微操縱器（micromanipulator)切割激光束（lasermicrobeam)切割1996年美國國立衛(wèi)生院國家腫瘤研究所推出LCM技術(shù)間接獲取靶細(xì)胞間接獲取靶細(xì)胞激光捕獲顯微切割的原理

激光捕獲顯微切割的基本原理是通過低能紅外激光脈沖激活熱塑膜——乙烯乙酸乙烯酯聚合物（ethylenevinylacetatepolymer,EVA膜)，隨后瞬時冷卻，選擇性地將靶細(xì)胞粘附于膜上，再通過特定的裂解液將靶細(xì)胞轉(zhuǎn)運至EP管中。EVA膜具有透明的熱塑性，含有吸收近紅外線的特殊染料，不吸收顯微鏡所使用的可見光，當(dāng)使用波長與該染料所特異吸收的波長相一致的激光束照射時，激光的能量絕大部分被EVA膜吸收，隨著溫度的升高，EVA膜的粘滯度急劇下降，保證了局部的輕度加熱就能使其滲透到細(xì)胞間隙，并迅速冷卻，固化成牢固的連接，足以使靶細(xì)胞脫離切片。激光捕獲顯微切割的應(yīng)用DNA水平的研究RNA水平的研究蛋白質(zhì)水平的研究激光捕獲顯微切割的優(yōu)點

快速，簡便，易行；還可避免無關(guān)細(xì)胞和碎片的污染。準(zhǔn)確度高。定位準(zhǔn)確程度可以達(dá)到1μm,捕獲點范圍達(dá)到3-5μm,因而足以捕獲單個細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)構(gòu)完整。不僅捕獲的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，而且剩余組織的結(jié)構(gòu)也未破壞。特異性強。

注意事項1．載玻片上的組織不可太干燥，可用二甲苯保持組織的濕度，在切割前使二甲苯蒸發(fā)。2．采用冰凍組織切片進(jìn)行顯微切割時應(yīng)注意切片的厚度，一般在4~10um為宜。3．在切割前可將切片浸在3%的甘油內(nèi)30s，這樣可以降低組織的脆性，并且較容易移取切割下的組織成分。4．在每次切割前，應(yīng)先進(jìn)行收集器，PCR管蓋底觀察位置焦面，激光切割線的校準(zhǔn)，并在空白處進(jìn)行預(yù)切，以檢查參數(shù)設(shè)置是否妥當(dāng)，更換物鏡后應(yīng)再次檢查參數(shù)。食管癌組織癌細(xì)胞的激光捕獲顯微切割照片切割前組織照片切割后組織照片切割下來的組織照片第三章圖像信號采集系統(tǒng)基本內(nèi)容圖像信號采集的原理1圖像信號采集的應(yīng)用2圖像信號采集系統(tǒng)原理輸入系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換圖像采集系統(tǒng)A/D轉(zhuǎn)換計算機系統(tǒng)圖像處理的核心輸出系統(tǒng)打印機，光盤等一.圖像分析系統(tǒng)主要應(yīng)用

1：圖像處理:圖像質(zhì)量的改善,主要指對醫(yī)學(xué)或生物成像的處理與編輯，提高圖像的反差、清晰度，對圖像進(jìn)行必要的修飾；

2：圖像保存；

3：圖像測量。圖像信號采集系統(tǒng)的應(yīng)用二.圖像分析的具體應(yīng)用一----定量分析1:組織化學(xué)定量

核酸定量：Feulgen法特異對DNA染色，天青B法特異對RNA染色總蛋白定量：考馬斯亮蘭,萘酚黃s組蛋白：固綠多糖和糖原：PAS反應(yīng)酶類定量：堿性磷酸酶、酸性磷酸酶圖像信號采集系統(tǒng)的應(yīng)用2:免疫組化定量

某種特定蛋白的定量,受體配體的結(jié)合,抗原抗體的結(jié)合3:原位雜交

圖像信號采集系統(tǒng)的應(yīng)用幾何測量：面積，長度，直徑，周長等；區(qū)域測量：數(shù)目，面積百分比等；灰度測量：灰度值，光密度，積分光密度，透射率。

三.圖像分析的具體應(yīng)用二----圖像測量圖像信號采集系統(tǒng)的應(yīng)用（1）灰度值與物質(zhì)的濃度成反比，灰度值越高反映為陽性表達(dá)率越低，灰度值越低則陽性率越高。（2）光密度與物質(zhì)的濃度成正比，光密度值的大小代表染色的深淺，反映物質(zhì)的相對濃度。（3）積分光密度為構(gòu)成被測對像的所有像素點的光密度的和。其與物質(zhì)的質(zhì)量成正比，積分光密度值的大小代表被染色物質(zhì)的多少，反映物質(zhì)的相對含量。（4）平均透射率反映物體的透光性，亮意味著透光多，暗意味著透光少，光被吸收的多?；叶葴y量參數(shù)的意義應(yīng)用圖像分析的注意事項（1）應(yīng)選擇無疵點，無污漬的薄厚均勻的載玻片和蓋玻片。（2）使用相同的封片劑。（3）嚴(yán)格控制切片的厚度和染色條件的一致。（4）測量光密度的樣品最好不要復(fù)染，盡量減少樣品染色的不一致或不均勻。（5）圖像獲取時光的條件要求嚴(yán)格一致，盡量用40倍的物鏡采集圖像，以便測量時精確分割圖像。第四章細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要內(nèi)容基本概念基本操作檢測方法注意事項

細(xì)胞系(cellline)：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系。細(xì)胞株(cellstrain)：通過克隆形成法或選擇法從原代培養(yǎng)物細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)物成為細(xì)胞株。ATCC(AmericanTypeCultureCollection）庫：美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物庫。

基本概念原代培養(yǎng)(Primaryculture)：從直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)(PassageSubculture)：細(xì)胞從一個培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)移至另一個培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。小牛血清(calfserum)：取自出生10～30天的小牛。胎牛血清(fatalbovineserum）：取自剖腹產(chǎn)的胎?；蛐呐K穿刺方法獲得?；靖拍罨静僮髟囵B(yǎng)：從供體取得組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)。原代培養(yǎng)組織塊培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法器官培養(yǎng)法基本操作傳代方法：細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶70-80%時即可傳代懸浮細(xì)胞直接傳代離心傳代貼壁細(xì)胞棄去原培養(yǎng)液加胰酶消化終止消化離心重懸后傳代人原髓細(xì)胞白血病HL-20細(xì)胞人肝癌HepG2細(xì)胞基本操作凍存與復(fù)蘇4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-80℃16-18小時(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長期儲存。凍存程序原則：慢凍速溶培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

超凈臺CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)注意的問題：用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒。箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。CO2培養(yǎng)箱濾器純水儀細(xì)胞計數(shù):血球計數(shù)板計數(shù)法細(xì)胞數(shù)/mL=(4個格子細(xì)胞總和/4)x104(每一大格子長，寬均為1mm,深0.1mm,故每個大格子體積為0.1mm3,可容納

0.1ul,那么每ml溶液中所含細(xì)胞數(shù)即是視野中每一大格子細(xì)胞數(shù)的10000倍。）基本操作細(xì)胞檢測方法細(xì)胞活力的檢測臺盼藍(lán)染色法MTT法臺盼藍(lán)染色法：正常細(xì)胞不染色，死亡細(xì)胞呈藍(lán)色。細(xì)胞活力(%)=(總細(xì)胞數(shù)-著色細(xì)胞數(shù))÷總細(xì)胞數(shù)×100%判斷時間：1-3min內(nèi)計完。注意：為一種粗略的檢測存活細(xì)胞的方法，不能準(zhǔn)確反映細(xì)胞活力差異。細(xì)胞檢測方法

MTT比色法：活細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶催化四甲基偶氮唑鹽(MTT)，還原成紫色不溶性結(jié)晶物，沉積于細(xì)胞中。用酸性異丙醇或DMSO溶解后，于酶標(biāo)儀上測定光吸收值。紫色不溶性結(jié)晶物形成的多少與活細(xì)胞數(shù)目和功能狀態(tài)相關(guān)。細(xì)胞存活率=試驗組光吸收值÷對照組光吸收值×100%細(xì)胞檢測方法

MTT操作步驟

（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；1x105細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200uL，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間）

（2）加入MTT，20uL／孔；繼續(xù)培養(yǎng)3-4小時。

（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液，150uL／孔，將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。

（4）酶標(biāo)儀檢測各孔OD值（檢測波長490nm）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線。細(xì)胞檢測方法MTT實驗注意事項：1.設(shè)空白調(diào)零孔，即只加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞。2.每組平行設(shè)3-6孔。每組細(xì)胞密度一致。3.吸取培養(yǎng)液上清時，槍尖不能接觸細(xì)胞底部。如是懸浮生長的細(xì)胞，一定要離心后再吸上清液。4.檢測前，要震蕩搖勻。細(xì)胞周期的檢測

PI單染法(流式細(xì)胞儀)細(xì)胞檢測方法PI單染色法

(1)

離心收集細(xì)胞（1～5）×106，1000rpm,5min,棄去上清液；

(2)PBS洗滌2次x5min；

(3)離心去PBS，用預(yù)冷的70%酒精固定，4℃過夜；

(4)離心去酒精，PBS洗滌2次x5min；

(5)加PI染液100μL，4

℃避光染色30min；

(6)上流式細(xì)胞儀檢測，并用隨機軟件分析。

細(xì)胞檢測方法細(xì)胞凋亡的檢測

PI單染法(流式細(xì)胞儀)；

Annexin-V/PI雙染法(流式細(xì)胞儀，共聚焦顯微鏡)；

TUNEL試劑盒；

DNALadder；

電鏡檢測凋亡小體；

凋亡相關(guān)蛋白的檢測：如：Bcl-2,Bax,Caspase-3等?？捎妹庖呓M化法；流式細(xì)胞儀；共聚焦顯微鏡；Westernblot.細(xì)胞檢測方法Annexin-V/PI雙染法

標(biāo)記的Annexin-V檢測細(xì)胞外膜上的磷脂酰絲氨酸；PI可以結(jié)合死亡或凋亡細(xì)胞DNA。

(1)離心收集細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌，1000rpm,2x5min；

(2)用250μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，并使其濃度為1×106/mL；

(3)取100μl細(xì)胞懸液于5mL流式管中，加入5μlAnnexin-v和10μl的PI溶液，室溫避光染色15min；

(4)在反應(yīng)管中加入400μlPBS，流式細(xì)胞儀分析。細(xì)胞檢測方法細(xì)胞檢測方法細(xì)胞內(nèi)離子濃度的檢測如：鈣離子(流式細(xì)胞儀，激光共聚焦顯微鏡）細(xì)胞膜離子通道的檢測如：鉀離子通道；鈉離子通道(膜片鉗)細(xì)胞內(nèi)自由基的檢測SOD,MDA檢測試劑盒；激光共聚焦顯微鏡細(xì)胞膜或線粒體膜電位的檢測流式細(xì)胞儀，激光共聚焦顯微鏡細(xì)胞內(nèi)SOD檢測（DCFH-DA標(biāo)記）保證細(xì)胞生長環(huán)境與操作環(huán)境的無菌。細(xì)胞傳代時間與實驗用細(xì)胞均應(yīng)處于對數(shù)生長期。盡可能保證培養(yǎng)細(xì)胞用的培養(yǎng)基或血清為同一批次的。血清，胰蛋白酶應(yīng)分裝保存，避免反復(fù)凍融。血清首次用前要熱滅活補體（56水浴，30min)。細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的原則：慢凍速溶。血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子，同對也存在細(xì)胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。故培養(yǎng)用血清濃度不宜過高。細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的問題

第五章流式細(xì)胞儀在醫(yī)學(xué)研究中的作用主要內(nèi)容流式細(xì)胞儀原理流式細(xì)胞儀的應(yīng)用注意事項流式細(xì)胞儀原理

概念流式細(xì)胞術(shù)是２０世紀(jì)７０年代發(fā)展起來的一種快速對單細(xì)胞進(jìn)行定量分析和分選的新技術(shù)

。如測量細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì),如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質(zhì)、抗原等,并可對其分類收集。流式細(xì)胞儀結(jié)合了三大體系：流體力學(xué)，光學(xué)，及電子學(xué)。隨著單克隆抗體技術(shù)、熒光染料技術(shù)等多學(xué)科新技術(shù)高度發(fā)展,它在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。流式細(xì)胞儀原理DOTPLOT流式細(xì)胞儀原理光的散射信號在流式細(xì)胞儀是非常有價值的信息：FSC(前向散射光或小角度散射)：細(xì)胞相對大?。籗SC(側(cè)向散射光或大角散射)：細(xì)胞顆粒度及內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的特性；FL1,FL2,FL3,FL4,等：不同的熒光波段。

散射光和熒光信號接收后經(jīng)Ａ／Ｄ轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號送計算機處理,可在計算機上直觀地統(tǒng)計染上各種熒光染料的細(xì)胞各自的百分率。選擇不同的單克隆抗體及熒光染料,可同時測定一個細(xì)胞上的多種不同的特征,如細(xì)胞大小、ＤＮＡ含量、細(xì)胞表面抗原表達(dá)、癌基因蛋白等等。流式細(xì)胞儀的應(yīng)用

免疫學(xué)中的應(yīng)用

常用于免疫細(xì)胞的分類、分型,而且還能再進(jìn)一步區(qū)分各系的亞群。例如用抗ＣＤ4、ＣＤ8、ＣＤ3、ＣＤ56、ＣＤ16的單克隆抗體可以將Ｔ淋巴細(xì)胞分為Ｔ輔助細(xì)胞亞群，Ｔ抑制細(xì)胞亞群，并區(qū)分出自然殺傷細(xì)胞(ＮＫ)，然后通過對ＴＨ、ＴＳ和ＮＫ細(xì)胞水平的測定，檢測機體的免疫狀態(tài)。

血液學(xué)中的應(yīng)用

對惡性血液病尤其是白血病可進(jìn)行分類，另外它通過對細(xì)胞周期相關(guān)的參數(shù)與惡性細(xì)胞相關(guān)表面抗原標(biāo)志同時測定，可以了解這種細(xì)胞的動力學(xué)特點和惡性細(xì)胞的來源，以期達(dá)到個體化化療的目的。流式細(xì)胞儀的應(yīng)用流式細(xì)胞儀的應(yīng)用

腫瘤研究中的應(yīng)用

流式細(xì)胞儀的出現(xiàn)給腫瘤的病理學(xué)診斷帶來了飛躍，用于測定細(xì)胞ＤＮＡ含量，分辨率高,精確，可為判斷腫瘤的生物學(xué)行為提供客觀而準(zhǔn)確的資料，輔助腫瘤的早期診斷和鑒別診斷。ＤＮＡ非整倍體的出現(xiàn)是癌前病變發(fā)生早期癌變的一個重要指標(biāo)。淋巴瘤、白血病的早期階段不像上皮性腫瘤的癌變或癌變早期具有一定組織上的特征，但應(yīng)用流式細(xì)胞儀可測得正常細(xì)胞和異常細(xì)胞ＤＮＡ含量的微小差別。

標(biāo)本來源

血液、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)液、胸水、腹水、灌洗液、新鮮實體瘤及活檢組織標(biāo)本、石蠟固定標(biāo)本等。注意事項1細(xì)胞數(shù)量要求達(dá)到一定的數(shù)目，一般在105-107；貼壁細(xì)胞的收集過程中要注意不能消化過久，以防碎片過多；細(xì)胞固定時要充分打散，以防出現(xiàn)細(xì)胞塊，堵塞機器噴嘴；如連續(xù)測量多個時間點的樣品，可將固定好的樣品置于-20℃，最后一個時間點一起染色上機檢測。第六章激光掃描共聚焦顯微鏡主要內(nèi)容激光掃描共聚焦顯微鏡原理共聚焦顯微鏡與普通顯微鏡的不同共聚焦顯微鏡的應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡的原理Confocal利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現(xiàn)點照明和點探測，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發(fā)射的熒光成像在探測針孔上，該點以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即共焦點，被探測點所在的平面即共焦平面。計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。激光共聚焦顯微鏡的原理激光共聚焦顯微鏡原理示意圖共聚焦顯微鏡與普通顯微鏡的不同抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片增加側(cè)向分辨率由于點對點掃描去除了雜散光的影響1.多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集2.無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT”3.真正的三維重組4.假三維圖的顯示5.可沿Z軸（xy平面）和Y軸（xz平面）方向進(jìn)行光切6.定量分析7.時間序列掃描:xyt、xyzt和xt掃描8.圖像處理9.旋轉(zhuǎn)掃描10.感興趣區(qū)域掃描11.光譜掃描

激光共聚焦的功能激光共聚焦的應(yīng)用定位、定量三維重組動態(tài)測量活細(xì)胞或組織內(nèi)游離Ca2+分布和濃度的變化測量（Mg2+、Zn+、Na+、K+)

自由基的檢測藥物進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程、定位分布及定量蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位活細(xì)胞內(nèi)H+濃度（pH值）的測量線粒體膜電位的測量其他應(yīng)用激光共聚焦的應(yīng)用一、具體應(yīng)用一------定位、定量免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三標(biāo)）的定位、定量：如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布，微絲、微管的分布、兩種或三種蛋白的共定位、蛋白與細(xì)胞器的共定位，核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位和干細(xì)胞的增殖、分化。細(xì)胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI末端原位雜交-fitc+PI熒光原位雜交：染色體基因定位

激光共聚焦的應(yīng)用二：具體應(yīng)用二------標(biāo)記細(xì)胞器線粒體溶酶體高爾基體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞核激光共聚焦的應(yīng)用三.具體應(yīng)用------動態(tài)測量細(xì)胞內(nèi)離子動態(tài)變化測量1)游離Ca2+測量

2）藥物進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程及定位分布

xyzt掃描激光共聚焦的應(yīng)用第七章WesternBlot主要內(nèi)容基本知識點主要操作步驟注意事項基本知識點

SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，這樣SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)。由于SDS和DTT的作用，蛋白質(zhì)完全變性和解聚，解離成亞基或單個肽鏈，因此測定的結(jié)果只是亞基或單條肽鏈的分子量。SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于用于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度。

SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍*丙烯酰胺濃度（%）線性分離范圍（kD）

1512～431016～687.536～945.057～212*雙丙烯酰胺～丙烯酰胺摩爾比為1：29?；局R點主要操作步驟蛋白質(zhì)分離(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)轉(zhuǎn)膜免疫染色(抗原-抗體反應(yīng))主要操作步驟蛋白質(zhì)的分離SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳注意：

每孔上樣蛋白質(zhì)的總量應(yīng)一致；上樣體積不超過20μl。

濾紙濾紙膠膜主要操作步驟轉(zhuǎn)膜（半干法）主要操作步驟免疫顯色封閉一抗二抗顯色干燥保存注意事項1：膜＞膠＝濾紙；短路的原因是上下濾紙有接觸，只要避免接觸就行。濾紙在轉(zhuǎn)移緩沖液中濕潤時會擴(kuò)大，這點在裁剪濾紙時應(yīng)考慮到。

2：膠濃度的選擇，電壓與電流的選擇應(yīng)根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小和膜面積而定。凝膠上所加電壓為8V/cm2。3：要標(biāo)記內(nèi)參照（GAPDH或β-actin)4：轉(zhuǎn)膜與封閉要排除氣泡；整個操作過程應(yīng)戴手套。第八章膜片鉗主要內(nèi)容膜片鉗的原理膜片鉗的應(yīng)用膜片鉗的概念1976年由德國生理學(xué)家Nehetr和Sakmann建立的膜片鉗技術(shù)是一種以記錄過離子通道的離子電流來反映細(xì)胞上單一的(或數(shù)個)離子通道活動的技術(shù)“它為從分子水平了解生物膜離子通道的門控動力學(xué)特征及通透性和選擇性等膜信息,提供了最直接的手段。作為先進(jìn)的細(xì)胞電生理技術(shù),膜片鉗一直被奉為研究離子通道的金標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用膜片鉗技術(shù)可以證實細(xì)胞膜上離子通道的存在并能對其電生理特性，分子結(jié)構(gòu)，藥物作用機制等進(jìn)行深入的研究。

該技術(shù)可將一尖端經(jīng)加熱拋光的玻璃微電極吸管吸附一片只有幾平方微米的細(xì)胞膜,形成吸管內(nèi)外近似電密封。再在吸管內(nèi)施以負(fù)壓,使微電極尖端與記錄的細(xì)胞膜片表面形成封接,因而可通過微電極直接對膜片進(jìn)行電壓鉗制,無需使用其它微電極。膜片鉗技術(shù)對膜電壓的鉗制是通過負(fù)反饋回路而實現(xiàn)的。這種負(fù)反饋電路要求細(xì)胞膜電位在所有時間都與經(jīng)放大器輸出的指令電壓相等。當(dāng)由于離子通道的開放造成膜電位與指令電位之間發(fā)生差異時,微電極放大器就通過記錄電極向胞內(nèi)自動注入大小相等和方向相反的電流而使膜電位得以鉗制，通過記錄放大器用以維持細(xì)胞膜鉗制電位所輸出的電流大小,即可推算出由于離子通道開放所產(chǎn)生的電流大小,以及由此導(dǎo)致的膜電導(dǎo)的改變。

膜片鉗原理膜片鉗主要功能

直接觀察和分辨單離子通道電流及其開閉時程；區(qū)分離子通道的離子選擇性；能在記錄單細(xì)胞電流和全細(xì)胞電流的基礎(chǔ)上進(jìn)一步計算出細(xì)胞膜上的通道數(shù)和開放概率；膜片鉗的主要應(yīng)用細(xì)胞膜離子通道的性質(zhì)鑒定及其動力學(xué)研究；研究細(xì)胞分泌：其原理在于細(xì)胞分泌的胞吐過程是在細(xì)胞膜上進(jìn)行的,它會引起細(xì)胞形態(tài)的改變和物質(zhì)流動,從而導(dǎo)致膜片參數(shù)發(fā)生變化。尤其是伴隨著分泌活性,整個細(xì)胞表面積(與膜電容比較)必然增加,通過測量細(xì)胞膜電容,便可估計單細(xì)胞分泌活性；研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；研究新的