轉(zhuǎn)錄組分析(rna-seq)備課講稿

轉(zhuǎn)錄組分析(RNA-Seq)RNA-Seq的技術(shù)背景

RNA-Seq又稱轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序（transcriptomesequencing）或稱為全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測(cè)序（WholeTranscriptomShotgunSequencingWTSS）原則上,所有的高通量測(cè)序技術(shù)都能進(jìn)行RNA測(cè)序。自2005年以來(lái),以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標(biāo)志的新一代測(cè)序技術(shù)相繼誕生,之后HelicosBiosciences公司又推出單分子測(cè)序(Singlemoleculesequencing,SMS)技術(shù)。新一代測(cè)序又稱作深度測(cè)序或高通量測(cè)序,是相對(duì)于傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序而言,主要特點(diǎn)是測(cè)序通量高,測(cè)序時(shí)間和成本顯著下降。各平臺(tái)測(cè)序原理及序列長(zhǎng)度的差異決定了各種高通量測(cè)序儀具有不同的應(yīng)用側(cè)重轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的集合轉(zhuǎn)錄組？RNA-Seq原理把高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用到由mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA上,從而獲得來(lái)自不同基因的mRNA片段在特定樣本中的含量,這就是mRNA測(cè)序或mRNA-Seq,同樣原理,各種類型的轉(zhuǎn)錄本都可以用深度測(cè)序技術(shù)進(jìn)行高通量檢測(cè),統(tǒng)稱作RNA-Seq-5-TotalRNA

RichmRNA(polyARNA)

Fragmentation(200~700bp)Oligo(dT)primedcDNAsynthesisPaired-endSolexaSequencingRandomhexamerprimedcDNAsynthesisRNAfragment(200~700nt)RandomhexamerprimedcDNAsynthesisProcedureofRNA-Seq1.樣品RNA準(zhǔn)備2.測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建使用oligodT微珠純化mRNAmRNA片段化處理反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成合成雙鏈cDNA雙鏈DNA末端修復(fù)及3’末端加‘A’使用特定的測(cè)序接頭連接DNA片段兩端高保真聚合酶擴(kuò)增構(gòu)建成功的測(cè)序文庫(kù)3.DNA成簇（Cluster）擴(kuò)增4.高通量測(cè)序（IlluminaGenomeAnalyzerIIx）5.數(shù)據(jù)分析原始數(shù)據(jù)讀取與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)并進(jìn)行注釋深層次數(shù)據(jù)分析RNA-Seq的應(yīng)用領(lǐng)域

圖所示RNA-seq獲得的數(shù)據(jù)能夠進(jìn)行全面的數(shù)據(jù)挖掘，既能夠進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，鑒定UTR、可變剪切位點(diǎn)，也能夠發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本及非編碼RNA，比較樣本間的表達(dá)水平差異RNA-Seq面臨的挑戰(zhàn)龐大的數(shù)據(jù)量所帶來(lái)的信息學(xué)難題如何針對(duì)更復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組來(lái)識(shí)別和追蹤所有基因中罕見(jiàn)RNA亞型的表達(dá)變化目前的高通量測(cè)序技術(shù)大都需要較多的樣品起始量,這使得來(lái)源極為有限的生物樣品分析受到限制,因此如何對(duì)單細(xì)胞或少量細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題RNA-seq常見(jiàn)問(wèn)題送樣要求：濃度≥400ng/ul，RNA總量≥20ug；OD260/280為1.8-2.2，28S/18S＞1.8，RIN≥8.在進(jìn)行原核生物轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)需要提供純化后的原核生物mRNA或cDNA樣品。進(jìn)行非編碼RNA測(cè)序時(shí)需要提供去除rRNA和tRNA的RNA樣品。測(cè)序1Gb的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)時(shí)通?？梢缘玫介L(zhǎng)度大于500bp的Unigene12000個(gè)以上，但轉(zhuǎn)錄組大小受基因數(shù)目和基因豐度雙重影響，組織差異、狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)處理也會(huì)影響轉(zhuǎn)錄組組成。RNA-Seq的發(fā)展前景1、雖然RNA-Seq技術(shù)還面臨著種種困難,但作為一個(gè)剛剛起步的新技術(shù)RNA-Seq已經(jīng)顯示出其他轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)：既能提供單堿基分辨率的轉(zhuǎn)錄組注釋又能提供全基因組范圍的“數(shù)字化”的基因表達(dá)譜,而且其成本通常比芯片和大規(guī)模的SangerEST測(cè)序要低,有2、就目前來(lái)看,作為兩個(gè)高通量的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù),在應(yīng)用的某些方面既存在重疊和競(jìng)爭(zhēng)也存在優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),一種技術(shù)能彌補(bǔ)另一種技術(shù)遺漏的部分,通常對(duì)一個(gè)生物學(xué)問(wèn)題的回答需要不同實(shí)驗(yàn)技術(shù)的協(xié)同配合3、RNA-Seq的強(qiáng)項(xiàng),就在于它是一個(gè)“開放系統(tǒng)”,它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的信息的能力從本質(zhì)上高于芯片技術(shù),相信隨著相關(guān)學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展和測(cè)序成本的進(jìn)一步降低,RNA-Seq必將在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究領(lǐng)域占主導(dǎo)地位特點(diǎn)數(shù)字表達(dá)譜芯片數(shù)字化信號(hào)√高通量√√