基因工程原理-第一章緒論

基因工程原理PrincipleofGeneEngineering

第一章第一節(jié)基因工程原理第一章基因研究的發(fā)展階段：染色體遺傳學(xué)分子生物學(xué)反向生物學(xué)50s70s染色體水平DNA水平DNA重組1909年，丹麥W.Johannsen，Gene專業(yè)名詞誕生，“給予生命”1857－1864：孟德?tīng)柾攵闺s交試驗(yàn)（遺傳因子的獨(dú)立分配規(guī)律）1910年：摩爾根果蠅遺傳學(xué)研究（遺傳的染色體理論）1944年：Avery細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（基因的化學(xué)本質(zhì)是DNA）1953年：Watson-CrickDNA雙螺旋模型學(xué)習(xí)內(nèi)容概論DNA重組（限制性內(nèi)切酶）運(yùn)輸工具——基因克隆載體目的基因的制備目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞外源基因的表達(dá)基因工程的應(yīng)用第一章第一節(jié)基因工程原理基本要求掌握基因克隆的基本工具，特別是不同的載體?？寺』虻幕痉椒?。怎樣利用基因重組技術(shù)研究基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和調(diào)控。利用基因工程生產(chǎn)重組蛋白，基因工程在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。能夠設(shè)計(jì)一個(gè)基因克隆的程序。PCR技術(shù)基本原理和應(yīng)用能夠根據(jù)酶切結(jié)果判讀酶切圖譜，以及判讀DNA序列的能力。第一章第一節(jié)基因工程原理《基因工程》，龍敏南等著，科學(xué)出版社，普通高等教育“十一五”國(guó)家級(jí)規(guī)劃教材參考書(shū)Genecloning,T.A.Brown.Thirdedition.基因工程原理，吳乃虎編著，科學(xué)出版社基因工程概論，張惠展編著，華東理工大學(xué)出版社。植物基因工程原理與技術(shù)，王關(guān)林，方宏筠主編，科學(xué)出版社。分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，J.Sambtook,EFFrish,TManiatis,金冬雁，黎孟楓等譯，科學(xué)出版社。第一章第一節(jié)基因工程原理第一章緒論——基因工程概況1.1引言1.1.1基因工程含義——指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其它載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使其摻入到原先沒(méi)有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定繁殖。

基因工程英文：

geneticengineering,genemanipulation,recombinantDNAtechnique,genecloning,molecularcloning目的基因的制備DNA重組（限制性內(nèi)切酶）運(yùn)輸工具——基因克隆載體目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞外源基因的表達(dá)基因工程：在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使其摻入到原先沒(méi)有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定繁殖。關(guān)鍵要素：1.1.2基因工程理論依據(jù)基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)：DNA基因可切割基因可轉(zhuǎn)移多肽——基因遺傳密碼通用性：三聯(lián)密碼基因遺傳1.1.3基因工程研究的基本路線基因工程：在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其它載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使其摻入到原先沒(méi)有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定繁殖。1.1.4基因工程發(fā)展史（1）理論上的三大發(fā)現(xiàn)：1944,Avery的肺炎雙球菌實(shí)驗(yàn),確定了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA。DNA的分子結(jié)構(gòu)及復(fù)制機(jī)理：50年代，Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制的機(jī)理。1958，Crick提出“中心法則”；1961年，Jacob和Monod“操縱子學(xué)說(shuō)”

DNA——RNA-——蛋白質(zhì)

闡明了遺傳物質(zhì)的流向和表達(dá)問(wèn)題。1.1.4基因工程發(fā)展史（1）理論上的三大發(fā)現(xiàn)：1944,Avery的肺炎雙球菌實(shí)驗(yàn),確定了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA。DNA的分子結(jié)構(gòu)及復(fù)制機(jī)理：50年代，Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制的機(jī)理。1958，Crick提出“中心法則”；1961年，Jacob和Monod“操縱子學(xué)說(shuō)”

DNA——RNA-——蛋白質(zhì)

闡明了遺傳物質(zhì)的流向和表達(dá)問(wèn)題。1.1.4基因工程發(fā)展史（1）理論上的三大發(fā)現(xiàn)：1944,Avery的肺炎雙球菌實(shí)驗(yàn),確定了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA。DNA的分子結(jié)構(gòu)及復(fù)制機(jī)理：50年代，Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制的機(jī)理。1958，Crick提出“中心法則”；1961年，Jacob和Monod“操縱子學(xué)說(shuō)”

DNA——RNA-——蛋白質(zhì)

闡明了遺傳物質(zhì)的流向和表達(dá)問(wèn)題。DNA分子的體外切割與連接技術(shù)

1970年，Smith等在流感嗜血桿菌中分離純化了核酸限制性內(nèi)切酶HindⅢ；1972年，EcoR

Ⅰ。DNA分子的核苷酸序列分析技術(shù)基因工程載體

pBR322和pUC13等載體。Cohen發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pSC101，并作為基因工程的載體使用.（2）技術(shù)上的三大發(fā)明：（3）基因工程的誕生猿猴病毒SV40DNAλ噬菌體DNAEcoRI切割T4DNA連接酶重組DNA分子1972年,美國(guó)斯坦福大學(xué)的P.Berg第一次實(shí)現(xiàn)了DNA體外重組。1973年，Cohen等獲得了抗四環(huán)素和新霉素的重組菌落TcrNer，標(biāo)志著基因工程的誕生：TetracyclinepSC101EcoRIDNA連接酶KanamycinR6-5Kanr和Tetr重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌

Cohen體外重組實(shí)驗(yàn)的意義：1.pSC101質(zhì)?？梢宰鳛榛蚩寺〉妮d體.2.能夠?qū)⑼庠碊NA導(dǎo)入寄主細(xì)胞.3.質(zhì)粒-大腸桿菌是一種成功的基因克隆體系.1977年，E.coli中合成了人生長(zhǎng)激素基因。1978-1979胰島素基因在大腸桿菌中表達(dá)。1982年，培育出了超級(jí)鼠。1985年Horsch發(fā)明了植物基因工程的基本方法：葉圓盤法，并獲得轉(zhuǎn)基因植株。1990年，患有遺傳免疫疾病的4歲女孩接受了基因療法。1990年，Perlak將B.T.基因?qū)朊藁ǐ@得抗蟲(chóng)棉。1991年，美國(guó)開(kāi)始人類基因組計(jì)劃。1997年，“多利”綿羊誕生。（4）發(fā)展過(guò)程中的重大事件轉(zhuǎn)移大鼠生長(zhǎng)素基因的小鼠

1.2基因工程研究?jī)?nèi)容目的基因分離制備重組DNA分子重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆提取已擴(kuò)增的目的基因目的基因克隆到表達(dá)載體上，表達(dá)，產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物第一次課結(jié)束瓊脂糖凝膠電泳(0.2-50kbDNA)

聚丙烯酰胺凝膠電泳(1-1000bpDNA)1.3基因操作的基本技術(shù)（1）凝膠電泳：一種分子放置在電場(chǎng)中,會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。凝膠的分辨能力:凝膠的類型和凝膠的濃度有關(guān)凝膠電泳的作用:分析,制備和純化溴化乙錠:簡(jiǎn)稱EB.EB的工作原理：溴化乙啶插入的EB-+電泳方向EB分辨率：0.05μg/帶原理:帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合，互補(bǔ)區(qū)段會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。（2）核酸的分子雜交1968年華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院RoyBritten等常見(jiàn)的分子雜交：Southernblotting：DNA，DNA/RNA

Northernblotting：RNA，DNA/RNA

Dot/slotblotting：DNA芯片insituhybridization：組織原位雜交Westernblotting：蛋白質(zhì)/抗原、抗體待測(cè)分子探針SouthernBlotting雜交:總DNA分子酶切DNA片段電泳變性、轉(zhuǎn)移到濾膜上用32P標(biāo)記的DNA探針雜交洗脫放射自顯影（核酸印跡）（印跡雜交）——1975年，英國(guó)人Southern創(chuàng)建，是研究DNA圖譜的基本技術(shù)。Southern印跡雜交顯色圖片用途：確定DNA大小，鑒定DNA轉(zhuǎn)化結(jié)果。NorthernBlotting雜交:1979年，J.C.Alwine等，應(yīng)用于特定性狀基因在mRNA水平上的動(dòng)態(tài)表達(dá)研究。。流程：RNA混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳→分離得到的RNA轉(zhuǎn)膜→與放射性標(biāo)記的探針雜交→結(jié)果分析（3）細(xì)菌的轉(zhuǎn)化（Transformation）

——一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳性改變的生命過(guò)程。

雙脫氧鏈終止法（Sanger法）：英國(guó)生物化學(xué)家FrederickSanger于1977年發(fā)明（4）DNA核苷酸序列分析模板標(biāo)記的引物DNA聚合酶dNTP雙脫氧鏈終止物ddNTP反應(yīng)組成檢測(cè)方法：電泳放射自顯影讀出DNA序列長(zhǎng)度：250bpSanger法基本過(guò)程：*****CGTACCTCGTTCATGACAAGCGTCTCAddGAGTddCGCAGAGTddTGTTCGCAGAGTddACTGTTCGCAGAGT****DNASequencingviatheSangerMethod模板標(biāo)記的引物DNA聚合酶dNTP雙脫氧鏈終止物ddNTPFrederickSanger

1918年8月13日－2013年11月19日，英國(guó)生物化學(xué)家。是第四位兩度獲得諾貝爾獎(jiǎng)，以及唯一獲得兩次化學(xué)獎(jiǎng)的人。1958年：確定胰島素結(jié)構(gòu)，獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1980年：發(fā)明Sanger測(cè)序法，再諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)化學(xué)降解法(Maxam-Gilbert法）：250bp1977年，A.M.Maxam和W.Gilbert建立的DNA片段序列的測(cè)定方法DNA分子末端放射性標(biāo)記電泳四個(gè)獨(dú)立的降解體系放射自顯影G反應(yīng)：G甲基化（硫酸二甲酯）G+A反應(yīng)：A和G質(zhì)子化（甲酸）T+C反應(yīng)：T和C嘧啶環(huán)斷裂（肼）C反應(yīng)：C嘧啶環(huán)斷裂（高鹽、肼）DNA序列分析儀聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）1985年，美國(guó)，Mullis：體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。成果發(fā)表在Science上。（5）基因擴(kuò)增（geneamplification）1993年因發(fā)明PCR技術(shù)，與邁克爾·史密斯分享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)KaryBanksMullis，1944年12月28日－“我感謝諾貝爾評(píng)獎(jiǎng)委員會(huì),在我還能夠盡情享受生活的年齡及時(shí)地把諾貝爾獎(jiǎng)授予給我.”“Fishdon’tknowmuchaboutwater,andpeopledidn’tknowmuchaboutair.”

“Play!Experiment!Discover!”基本原理：高溫變性低溫退火中溫延伸1.4基因克隆需要特殊的工具和技術(shù)運(yùn)輸工具：細(xì)菌質(zhì)粒病毒染色體DNA操作技術(shù)純化DNA 剪切DNA分子分析DNA片段大小連接DNA分子將DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞重組子的鑒定1.5基因工程的意義大規(guī)模的生產(chǎn)生物分子設(shè)計(jì)構(gòu)建新物種搜尋、分離和鑒定生物體尤其是人體內(nèi)的遺傳信息。醫(yī)藥重組藥物基因治療檢測(cè)遺傳疾病、病原農(nóng)業(yè)抗病蟲(chóng)提高品質(zhì)提高花卉的觀賞價(jià)值抗逆性家畜：瘦肉比；飼料利用率；加快生長(zhǎng)主要基因工程產(chǎn)品的研制、開(kāi)發(fā)、上市時(shí)間產(chǎn)品時(shí)間國(guó)家用途上市時(shí)間國(guó)家人生長(zhǎng)激素釋放抑