動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)和方法課件

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)

和方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作前必須注意的事1.動(dòng)物福利和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理問題飼養(yǎng)繁殖實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的目的是用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為人類的替難者進(jìn)行各種生物醫(yī)學(xué)研究。一方面隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用量逐年增加，使用種類也逐年擴(kuò)大；另一方面從動(dòng)物福利和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)考慮，又需要減少一些不必要的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，特別是人類的寵物諸如貓、犬、猴等，或者在不得不做的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中盡可能將動(dòng)物的痛苦、壓迫和不適降到最低。國(guó)際上對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理有如下五項(xiàng)要求:⑴動(dòng)物居住空間應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn),注意日常的飼育管理,不使動(dòng)物陷入饑餓、缺水和患病。⑵盡可能地采用代替法最少地使用和犧牲動(dòng)物。⑶在必須使用犬、貓和猴時(shí)，在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行訓(xùn)練，盡可能地減少動(dòng)物的恐懼和不安。⑷實(shí)驗(yàn)結(jié)束和動(dòng)物不可能恢復(fù)時(shí)，應(yīng)采取安樂死。⑸要愛護(hù)動(dòng)物和對(duì)由于實(shí)驗(yàn)死亡的動(dòng)物應(yīng)持有憐憫和感謝之情。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備1.所用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施是否符合本實(shí)驗(yàn)要求

普通設(shè)施，SPF設(shè)施，感染性設(shè)施，有毒有害供試品設(shè)施，放射性設(shè)施實(shí)驗(yàn)室、手術(shù)室2.所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品種、品系、性別、數(shù)量等能否得到所需要的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)是否熟練掌握所用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)器具、試劑是否準(zhǔn)備好5.預(yù)實(shí)驗(yàn)正式實(shí)驗(yàn)前的演習(xí)預(yù)實(shí)驗(yàn)可用少量動(dòng)物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能并入正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果一起分析。一、動(dòng)物的抓取動(dòng)物的抓取是順利進(jìn)行各項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作最基本的一個(gè)環(huán)節(jié)。應(yīng)熟練掌握各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抓取方法，用輕柔的手法把對(duì)動(dòng)物施加的恐懼和痛苦降到最低。一般說來動(dòng)物是不會(huì)主動(dòng)攻擊人的。小鼠抓取的注意點(diǎn)大鼠抓取的注意點(diǎn)3.豚鼠抓取的注意點(diǎn)5.犬抓取注意點(diǎn)實(shí)驗(yàn)用犬有專用的比格犬和農(nóng)村收購來的草犬。犬是通人性的，草犬購入后，飼養(yǎng)人員和實(shí)驗(yàn)人員要經(jīng)常親近它們，使它放松對(duì)你的警惕，容易直接抓取它們。不要輕易使用長(zhǎng)柄鐵鉗，鉗傷造成的傷害會(huì)使它對(duì)你更加恐懼，影響以后實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。抓取后用繩子將嘴綁住。二、動(dòng)物編號(hào)常用的標(biāo)記方法適用需要個(gè)體識(shí)別的實(shí)驗(yàn)染料標(biāo)記法：適合白色被毛的動(dòng)物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔等。

黃色：常用3~5%苦味酸溶液紅色：常用0.5%中性紅溶液咖啡色:2%硝酸銀溶液黑色：煤焦油酒精溶液優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、易識(shí)別

缺點(diǎn)：長(zhǎng)期易退色；不能編大號(hào)碼。三、動(dòng)物被毛的去除方法1.剪毛法：用彎頭剪逆毛方向剪適用于各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2.拔毛法：常用于兔的耳緣靜脈注射3.剃毛法：剃須刀、手術(shù)刀適用于大動(dòng)物4.脫毛法：脫毛劑常用脫毛劑配方配方1：硫化鈉8g溶于100mL水中。配方2：硫化鈉：肥皂粉：淀粉的比例為3：1：7，再加水調(diào)成糊狀。配方3：硫化鈉10g和生石灰15g溶于100mL水中。配方1和2適用于家兔和嚙齒類動(dòng)物的脫毛，配方3適合給犬脫毛。脫毛后用清水將脫毛區(qū)清洗干凈。四、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的麻醉方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行麻醉的目的是，消除實(shí)驗(yàn)過程中引起的痛苦和不適，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的安全和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理的一個(gè)重要方面。應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)動(dòng)物種類、日齡及健康狀況等因素進(jìn)行綜合考慮，決定選用的麻醉劑和麻醉方法。麻醉方法有全身麻醉和局部麻醉兩種。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的麻醉中絕大多數(shù)采用全身麻醉。（1）吸入麻醉法常用藥物為乙醚等。吸入麻醉法有開放吸入和氣管內(nèi)插管吸入兩種方法。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大都采用開放吸入法開放吸入：適用于嚙齒類小動(dòng)物，可用乙醚、氯仿小動(dòng)物吸入麻醉機(jī)國(guó)外已研制成功。氣管內(nèi)插管：適用于犬、猴、羊等大動(dòng)物，乙醚是最常用的麻醉藥。吸入麻醉的優(yōu)點(diǎn)：麻醉平穩(wěn)、安全可靠、停止吸入后很快蘇醒缺點(diǎn)：需要一定的儀器設(shè)備，吸入乙醚全麻的分期

第一期：鎮(zhèn)痛期指麻醉給藥開始到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物意識(shí)完全喪失的時(shí)期。此期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各種反射存在，肌張力正常，血壓升高，心跳加快。

第二期：興奮期

指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從意識(shí)和感覺消失到外科麻醉期開始的時(shí)期。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物掙扎、屏氣、瞳孔開大、眼球快速轉(zhuǎn)動(dòng)、血壓明顯升高、心跳明顯加快、呼吸不規(guī)則、各種反射亢進(jìn)。此期應(yīng)頻頻取開面罩，讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多次呼吸新鮮空氣。

第三期：外科麻醉期

指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由興奮狀態(tài)轉(zhuǎn)入抑制狀態(tài)的時(shí)期。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的呼吸由不規(guī)則狀態(tài)變?yōu)橐?guī)則狀態(tài)，血壓和心率平穩(wěn)、肌肉松弛、反射活動(dòng)下降，此期是實(shí)驗(yàn)操作的最佳時(shí)期。

第四期：麻醉中毒期

指麻醉過深導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于垂危狀態(tài)的時(shí)期。此期出現(xiàn)的時(shí)間不定，主要表現(xiàn)為心跳和呼吸微弱、不規(guī)則甚至停止，血壓急劇下降甚至測(cè)不到。如果搶救不及時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡。（2）注射麻醉法注射麻醉法是使用非揮發(fā)性麻醉藥進(jìn)行全麻的方法。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中比較常用。常用麻醉藥：戊巴比妥鈉硫噴妥鈉氯氨酮烏拉坦大動(dòng)物：靜脈注射或腹腔注射嚙齒類動(dòng)物：腹腔注射6.大動(dòng)物手術(shù)時(shí)應(yīng)配備麻醉師，在麻醉過程中密切觀察動(dòng)物的反應(yīng)，如血壓、脈搏、呼吸和體溫，及時(shí)調(diào)節(jié)麻醉藥劑量，保證手術(shù)順利進(jìn)行。7.動(dòng)物在麻醉期間、手術(shù)后至蘇醒期體溫會(huì)下降，應(yīng)注意手術(shù)室的室溫。8.注意術(shù)后護(hù)理。麻醉意外的搶救

原因：麻醉藥速度過快、劑量過大、麻醉過深

后果：中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)功能障礙，引起呼吸、心跳停止。

搶救方法：要針對(duì)具體情況，采取對(duì)癥治療的措施。1.立即停止供給麻醉劑2.人工呼吸，吸氧3.蘇醒劑4.呼吸中樞興奮劑如可拉明等和心臟和呼吸興奮劑，如0.1%腎上腺素適量作心內(nèi)或靜脈注射，靜脈滴注50%葡萄糖溶液等。五、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的給藥方法經(jīng)口給藥法注射法其它途徑給藥方法呼吸道給藥皮膚給藥脊髓腔內(nèi)給藥腦內(nèi)給藥直腸內(nèi)給藥關(guān)節(jié)腔內(nèi)給藥大小鼠灌胃注意點(diǎn)用灌胃針。從嘴角處插入，到達(dá)咽部后改變灌胃針的方向，使其與食管的走向一致，然后順利插入。成年大鼠由于體型較大，不易保定。辦法：1）一人保定，一人灌胃2）操作者抓取后，將大鼠尾部按在自己的胸部，達(dá)到固定尾部的目的，然后灌胃。兔灌胃法

采用兩人操作法。操作者用左手拇指和中指擠壓家兔兩頰，將下頜擠開使兔被動(dòng)張口，右手將開口器從一側(cè)口角插入口腔并固定，用泡在水中的14號(hào)細(xì)導(dǎo)尿管，經(jīng)開口器的孔插入，向前推進(jìn)約15cm，可達(dá)胃內(nèi)，確認(rèn)泡在水中的導(dǎo)管另一端沒有冒氣泡，說明沒有誤入氣管，即可注入藥液。灌胃量為每只每次80-150mL。注射法注射法有皮下注射、腹腔注射、靜脈注射、肌肉注射以及皮內(nèi)注射、腦內(nèi)注射等。藥物吸收速度：靜脈注射＞腹腔注射＞肌肉注射＞皮下注射。皮內(nèi)注射常用于觀察皮膚血管通透性變化或反應(yīng)，如過敏試驗(yàn)?zāi)X內(nèi)注射常用于病毒學(xué)接種靜脈注射大小鼠尾靜脈注射大鼠、沙鼠、豚鼠后肢淺背側(cè)足中靜脈注射兔耳緣靜脈注射4.犬前肢頭靜脈和后肢小隱靜脈注射尾靜脈其它途徑給藥方法呼吸道給藥：皮膚給藥：脊髓腔內(nèi)給藥：4.腦內(nèi)給藥：5.直腸內(nèi)給藥：6.關(guān)節(jié)腔內(nèi)給藥：（一）采血法大小鼠剪尾尾靜脈切割大鼠后肢足中靜脈采血眼眶后靜脈叢采血摘眼球采血腋窩動(dòng)靜脈采血心臟采血腹主動(dòng)脈采血六、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體液的采集方法大小鼠心臟采血眼眶后靜脈從采血尾靜脈切割采血一個(gè)動(dòng)物到底能采多少血，取決于動(dòng)物的體重、定期活體采血還是處死采血。動(dòng)物的全血量為動(dòng)物體重的8%左右，其中約30%儲(chǔ)藏在全身毛細(xì)血管內(nèi)。全血中約50%是有形成分。據(jù)此可測(cè)算處死后的采血量和血清量。采血為全血量的10%時(shí)，兩個(gè)星期恢復(fù)；采血為全血量的30%時(shí)，將危及生命。大小鼠不同采血方法的比較采血方法采血量（ml）應(yīng)用小鼠大鼠斷頭采血法0.2-1.01.5-5.0大批動(dòng)物集中處死采血，速度快摘眼球采血法0.2-1.51.0-8.0大批動(dòng)物集中采血，若一次少量采，可反復(fù)幾次尾靜脈切割采血法0.01-0.050.1-0.5用于用血量少的檢驗(yàn)，如血常規(guī)，能長(zhǎng)時(shí)期反復(fù)多次采血眼眶后靜脈采血法0.02-0.10.2-1.0能反復(fù)多次采血腋窩動(dòng)靜脈采血法0.5-1.51.0-5.0需處死動(dòng)物，麻醉后采血心臟采血法-0.2-1.0腹主動(dòng)脈采血法-5.0-10.0需處死動(dòng)物，麻醉后采血豚鼠1.豚鼠心臟采血兔兔耳緣靜脈采血兔頸動(dòng)脈采血犬犬前肢頭靜脈采血犬后肢外側(cè)小隱靜脈采血各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活體安全采血量和致死采血量動(dòng)物種類最大安全采血量（ml）最小致死采血量（ml）小鼠0.30.5大鼠25豚鼠510兔1040犬50300猴1560（二）采尿法反射排尿法代謝籠法導(dǎo)尿法膀胱穿刺法七、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用處死方法安死術(shù)的概念“安死術(shù)”是指以人道的方法處死動(dòng)物的過程。在處死動(dòng)物過程中減少動(dòng)物的驚恐或焦慮，安靜地、無痛苦地死亡。采用安死術(shù)必須符合的標(biāo)準(zhǔn)死亡時(shí)沒有驚恐、疼痛的表現(xiàn)使其在最短時(shí)間內(nèi)失去意識(shí)，迅速死亡方法可靠且可重復(fù)對(duì)操作人員安全采用的方法要與研究要求和目的一致對(duì)觀察者和操作者的情緒影響最小對(duì)環(huán)境污染的影響最小設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)廉、易操作處死動(dòng)物地點(diǎn)應(yīng)遠(yuǎn)離，并與動(dòng)物室隔開㈠大鼠小鼠1.脊椎脫臼法2.急性失血法3.麻醉致死法4.氣體窒息致死法㈡貓、犬、兔1.空氣栓塞法優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單、迅速，缺點(diǎn)：由于動(dòng)物死于急性循環(huán)衰竭，各臟器凝血十分明顯。2.急性失血法先行麻醉，再分離頸動(dòng)脈或股動(dòng)脈，將一根較粗的塑料管插入動(dòng)脈內(nèi)放血。動(dòng)物在3～5min內(nèi)即可死亡。優(yōu)點(diǎn)：動(dòng)物十分安靜，對(duì)臟器無損傷，對(duì)活殺采集病理切片標(biāo)本是一種比較好的方法。3.化學(xué)藥物致死法通過注射一定量的化