微生物檢驗(yàn)第九章分枝放線菌

微生物檢驗(yàn)第九章分枝放線菌第一頁，共四十頁，2022年，8月28日Mycobacterium是一類細(xì)長略帶彎曲的桿菌，含有分枝菌酸，有分枝生長的趨勢而得名。具有抗酸性，故又稱抗酸桿菌(acid-fastbacillus)。人結(jié)核分枝桿菌牛分枝桿菌非洲分枝桿菌第二頁，共四十頁，2022年，8月28日第一節(jié)結(jié)核分枝桿菌第三頁，共四十頁，2022年，8月28日莢膜：CR3結(jié)合、降解大分子物質(zhì)、保護(hù)、抑制溶酶體融合脂質(zhì)：索狀因子、磷脂、硫酸腦苷脂、蠟質(zhì)D蛋白質(zhì):超敏反應(yīng)、結(jié)核結(jié)節(jié)的形成傳播途徑：呼吸道、消化道、損傷的皮膚疾?。憾喾N臟器的結(jié)核病，肺結(jié)核最為多見。第四頁，共四十頁，2022年，8月28日免疫性：高感染率，低發(fā)病率?？贵w無保護(hù)作用帶菌免疫細(xì)胞免疫

細(xì)長略帶彎曲的桿菌，抗酸染色后結(jié)核分枝桿菌呈紅色，背景呈藍(lán)色。菌體外有莢膜。第五頁，共四十頁，2022年，8月28日專性需氧改良羅氏培養(yǎng)基生長緩慢表面干燥、不透明的菜花樣粗糙型菌落液體培養(yǎng)時生成菌膜第六頁，共四十頁，2022年，8月28日抵抗力較強(qiáng)。耐干燥，在干燥的痰內(nèi)生存6～8個月，對化學(xué)消毒劑的抵抗力較強(qiáng)，在3％HCl或6％H2SO4中不被殺死，對濕熱敏感,在70％～75％乙醇中數(shù)分鐘即被殺死。第七頁，共四十頁，2022年，8月28日結(jié)核分枝桿菌不發(fā)酵糖類，有毒株中性紅試驗(yàn)均陽性，無毒株則為陰性，并失去索狀生長現(xiàn)象。H2O2煙酸硝酸鹽人型結(jié)核分枝桿菌+++牛型結(jié)核分枝桿菌+

--第八頁，共四十頁，2022年，8月28日（1）DirectSmear

2.MorphologicExaminations

報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)-全視野未找到抗酸菌1+100個視野發(fā)現(xiàn)3～9個2+100個視野發(fā)現(xiàn)10～99個3+每個視野發(fā)現(xiàn)1～9個4+每個視野發(fā)現(xiàn)10個以上第九頁，共四十頁，2022年，8月28日（2）濃縮集菌涂片檢查法如果直接涂片鏡檢不易檢出結(jié)核桿菌，應(yīng)采用濃縮集菌涂片檢查法，以提高結(jié)核桿菌的檢出率。將標(biāo)本離心，取沉淀涂片，或采用漂浮集菌法，集菌后標(biāo)本經(jīng)反復(fù)多次使涂層加厚，一般取3~4個接種環(huán)，干燥固定后染色鏡檢。第十頁，共四十頁，2022年，8月28日3.核酸檢測用PCR法快速診斷結(jié)核分枝桿菌感染,特異性與敏感性均大于95％。４.抗原檢測：用ELISA法檢測結(jié)核分枝桿菌抗原，可快速得知是否感染結(jié)核分枝桿菌．５.抗PPDIgG的檢測用ELISA法檢測患者血清中抗PPDIgG，可作為活動性結(jié)核分枝桿菌感染的快速診斷方法，陽性率為80％～90％。第十一頁，共四十頁，2022年，8月28日６.分離培養(yǎng)專性需氧、羅氏培養(yǎng)基、8w

前處理目的：去除雜菌，痰液均質(zhì)化。方法：挑取5ml痰液至已經(jīng)標(biāo)記的50ml離心試管中；加入等量的2%N-乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉（NACL-NaOH）前處理液（去污染）；漩渦振蕩20秒；靜置15分鐘，切勿超過20分鐘；加入無菌PBS（PH6.8）至約50mL，蓋緊蓋子；離心3000r/min，15分鐘；倒掉上清液；添加1-3mlPBS（PH6.8）以中和PH至6.8.第十二頁，共四十頁，2022年，8月28日

無菌毛細(xì)管吸取消化后標(biāo)本0.1ml，滴加于中性羅氏培養(yǎng)基，將接種過的斜面來回晃動，使菌液均勻鋪于斜面上，斜面朝上放37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每一標(biāo)本同時接種2支。接種后第一周每天觀察一次，此后每周觀察一次。陽性結(jié)果經(jīng)涂片證實(shí)隨時報(bào)告。若7天內(nèi)報(bào)告陽性，則為快速生長菌，超過7日則為緩慢生長菌。陰性結(jié)果至8周報(bào)告。必要時可延長。第十三頁，共四十頁，2022年，8月28日７.鑒定

(1)PCR反向膜探針雜交E LISA法(PCR雜交梳)(2)DNA探針

(3)16srRNA基因序列測定

(4)高效液相色譜(HPLC)檢測

第十四頁，共四十頁，2022年，8月28日８.藥物敏感性試驗(yàn)

將純培養(yǎng)物菌懸液，接種含各種濃度藥物的固體培養(yǎng)基上，同時做不含藥物的對照組。經(jīng)過培養(yǎng)，含有藥物的培養(yǎng)基上菌落數(shù)目是對照組的75％以上，則認(rèn)為該菌對該藥物濃度為完全耐藥，如無菌落生長則為敏感。第十五頁，共四十頁，2022年，8月28日四、免疫學(xué)診斷1、結(jié)核菌素試驗(yàn)原理：純蛋白衍生物(PPD)，是用三氯醋酸沉淀結(jié)核菌培養(yǎng)濾液后的純化物。注入皮內(nèi)后如受試者已感染結(jié)核，則結(jié)核菌素與致敏淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合，形成遲發(fā)型超敏反應(yīng)性炎癥。第十六頁，共四十頁，2022年，8月28日

應(yīng)用：

①選擇BCG接種對象及測定接種效果，結(jié)核菌素反應(yīng)陰性者應(yīng)接種BCG；

②結(jié)核菌素試驗(yàn)對嬰幼兒可做診斷結(jié)核病之用；

③在末接種BCG的人群中作結(jié)核分枝桿菌感染的流行病學(xué)調(diào)查；

④可借用其測定腫瘤病人的細(xì)胞免疫功能。第十七頁，共四十頁，2022年，8月28日2、結(jié)核分枝桿菌抗原檢測3、結(jié)核分支桿菌抗體檢測4、全血干擾素釋放試驗(yàn)

ESAT、CFP-10第十八頁，共四十頁，2022年，8月28日第二節(jié)非典型分枝桿菌

指結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌。因具有抗酸性，故又稱非典型抗酸性菌。廣泛分布于外環(huán)境和人及動物的機(jī)體中。已發(fā)現(xiàn)50種以上能引起人類疾病，引起的肺部感染。第十九頁，共四十頁，2022年，8月28日特點(diǎn)1、對人類的致病性比MTB低。2、機(jī)體免疫力低下時作為繼發(fā)性疾病發(fā)生。3、與結(jié)核分支桿菌發(fā)生混合感染4、對抗結(jié)核藥物天然耐藥光產(chǎn)色分枝桿菌暗產(chǎn)色分枝桿菌不產(chǎn)色分枝桿菌迅速生長分枝桿菌第二十頁，共四十頁，2022年，8月28日—、光產(chǎn)色分枝桿菌

特點(diǎn)是在暗處不產(chǎn)生色素，光照1h后能在48h內(nèi)，菌落轉(zhuǎn)為黃色或橘黃色。對人有致病性的是：1．堪薩斯分枝桿菌廣泛分布于水和土壤中，能引起肺內(nèi)外結(jié)核樣的病變。2．海分枝桿菌為水中的腐生菌。通過皮膚微小創(chuàng)口侵入，引起所謂的“游泳池肉芽腫”。3．猿分枝桿菌先后從猿和人體分離出此菌。第二十一頁，共四十頁，2022年，8月28日二、暗產(chǎn)色分枝桿菌有光或無光均能產(chǎn)生色素，呈黃色或橘黃色。對人有致病性的為：1．瘰痢分枝桿菌25℃-37℃均可生長，35℃最為適宜，45℃則不能生長?？梢鹑肆馨徒Y(jié)炎或肺部感染。2．斯氏分枝桿菌37℃時為暗產(chǎn)色，25℃時為光產(chǎn)色。本菌引起成人肺部的慢性感染。第二十二頁，共四十頁，2022年，8月28日三、不產(chǎn)色分枝桿菌不能產(chǎn)生色素。對人有致病性的是：1．鳥-胞內(nèi)復(fù)合分枝桿菌(MAC/MAIC)AIDS患者易感染，對抗結(jié)核藥物不敏感或產(chǎn)生耐藥。2．潰瘍分枝桿菌通過創(chuàng)傷感染，四肢伸側(cè)形成無痛性潰瘍，緩慢愈合或出現(xiàn)繼發(fā)感染。3．蟾蜍分枝桿菌為蟾蜍肉芽腫的病原菌。多引起老年男性的慢性肺部感染。第二十三頁，共四十頁，2022年，8月28日四、迅速生長分枝桿菌

在普通培養(yǎng)基上生長速度快，生長溫度為25℃-45℃，對人有致病性的是：1．偶發(fā)分枝桿菌可引起人局部或肺部感染，對現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物均有耐藥性。2．龜分枝桿菌可引起人的軟組織病變及手術(shù)后繼發(fā)感染，亦可引起肺部感染。第二十四頁，共四十頁，2022年，8月28日第三節(jié)麻風(fēng)分枝桿菌

麻風(fēng)病的病原菌，麻風(fēng)是一種慢性傳染病，主要表現(xiàn)為皮膚、粘膜和神經(jīng)末梢的損害。晚期可侵犯深部組織和器官，形成肉芽腫。根據(jù)臨床表現(xiàn)、免疫病理變化和細(xì)菌檢查結(jié)果等將麻風(fēng)分為瘤型、結(jié)核樣型和界限類綜合征等三種病型。

第二十五頁，共四十頁，2022年，8月28日

抗酸桿菌，呈束狀或團(tuán)狀排列，G+無鞭毛、莢膜和芽胞。麻風(fēng)分枝桿菌為典型的胞內(nèi)寄生菌，有該菌存在的細(xì)胞胞質(zhì)呈泡沫狀稱麻風(fēng)細(xì)胞．用藥后細(xì)菌可斷裂為顆粒狀、鏈桿狀等，著色不均勻，叫做不完全菌。第二十六頁，共四十頁，2022年，8月28日微生物學(xué)檢驗(yàn)顯微鏡檢查：在鏡檢時應(yīng)注意與結(jié)核分枝桿菌桿菌形態(tài)相鑒別．麻風(fēng)分枝桿菌多呈束狀或成團(tuán)聚集．結(jié)核分枝桿菌多散在．麻風(fēng)分枝桿菌菌體粗直，兩端尖細(xì)，而結(jié)核分枝桿菌則細(xì)長略彎曲且有分枝現(xiàn)象．活組織切片：抗酸染色及病理學(xué)檢查第二十七頁，共四十頁，2022年，8月28日

放線菌屬

與

諾卡菌屬

第二十八頁，共四十頁，2022年，8月28日主要致病菌——衣氏放線菌（A.israelii)屬于正常菌群。在機(jī)體抵抗力減弱、口腔衛(wèi)生不良、拔牙或外傷時引起內(nèi)源性感染，導(dǎo)致軟組織的化膿性炎癥。若無繼發(fā)感染則大多呈慢性無痛性過程，并常伴有多發(fā)性瘺管形成，排出黃色硫磺樣顆粒，此即為放線菌病。最為常見的是面頸部感染。放線菌屬第二十九頁，共四十頁，2022年，8月28日致病性與免疫性放線菌：正常菌群所致疾?。?.內(nèi)源性感染(放線菌病)：軟組織肉芽腫性炎癥(慢性,無痛,多發(fā)性瘺管,排出硫磺樣顆粒)2.齲齒和牙周炎免疫性：細(xì)胞免疫第三十頁，共四十頁，2022年，8月28日G+、非抗酸性絲狀菌培養(yǎng)困難，厭氧或微需氧硫磺樣顆粒（菌落）壓片或組織切片，顯微鏡下可見顆粒呈菊花狀生物學(xué)性狀第三十一頁，共四十頁，2022年，8月28日硫磺樣顆粒(sulfurgranule)第三十二頁，共四十頁，2022年，8月28日培養(yǎng)：厭氧或微需氧氣體環(huán)境：5％CO2營養(yǎng)培養(yǎng)基：腦心浸液瓊脂平板溫度與時間：37℃，24～48h菌落:灰白色蜘蛛狀、不規(guī)則結(jié)節(jié)狀或臼齒狀菌落,

初分離(粗糙)生化特性:溶血(-)

葡萄糖(+)

甘露醇(+)

吲哚(-)

過氧化氫酶試驗(yàn)(-)第三十三頁，共四十頁，2022年，8月28日微生物學(xué)檢查主要：硫磺樣顆粒（膿汁,痰,分泌物）有顆粒：壓片鏡檢:菊花狀排列的菌絲無顆粒：分枝菌絲，斷裂的菌細(xì)胞必要：厭氧培養(yǎng)（緩慢，37℃培養(yǎng)2w以上）第三十四頁，共四十頁，2022年，8月28日諾卡菌屬1.需氧2.含分枝菌酸3.分布：土壤中，多數(shù)：非致病菌4.致病菌：星形諾卡菌（N.asteroides）巴西諾卡菌（N.brasiliensis）豚鼠諾卡菌（N.caviae）第三十五頁，共四十頁，2022年，8月28日生物學(xué)性狀形態(tài)：與以色列放線菌相似革蘭染色：陽性抗酸染色：陽性脫色時間延長陰性(與TB區(qū)別)

硫磺樣顆粒:

滲出液、痰或膿汁中有時可見淡黃、紅色或黑色小顆粒。

第三十六頁，共四十頁，2022年，8月28日營養(yǎng)要求：不高（沙氏或普通瓊脂培養(yǎng)基）氣體環(huán)境：需氧，有氣生菌絲培養(yǎng)溫度：室溫或37℃生長速度：緩慢生長，約1周色素：星形諾卡菌：黃色或深橙色，無白色菌絲巴西諾卡菌：有白色菌絲菌絲斷裂：5天后鏡檢可見鏈球狀或鏈桿狀（放線菌屬：24h開始)培養(yǎng)特征：菌落：有皺褶、顆粒狀第三十七頁，共四十頁，2022年，8月28日致病性侵入途徑：呼吸道或皮膚創(chuàng)傷所致疾?。褐Z卡菌?。╪ocardiosis）