基因操作原理08課件

第八章DNA文庫的構(gòu)建DNAlibraries基因文庫（Genelibrary）：由大量的含有基因組DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所構(gòu)成的群體,稱之為基因文庫。一個完全的基因文庫，應(yīng)該能夠保證從中篩選到目的基因。

即Genomiclibrary1976年L.Clark,J.Carbon提出了一個完全的基因文庫所需克隆的計(jì)算公式n=ln(1-p)/ln(1-f)n:一個完全基因文庫所應(yīng)包含的重組體克隆數(shù)p:所期望的目的基因在基因文庫中出現(xiàn)的幾率f:插入片段的平均大小與基因組DNA大小的比值cDNA文庫:若這些大量的重組DNA分子所含的外源DNA不是基因組DNA，而是由某一生物的特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA，它們所構(gòu)成的重組DNA克隆群體，則稱之為cDNA基因文庫一、載體的選擇第一節(jié)

基因組DNA文庫的構(gòu)建可裝載的外源DNAPlasmid<10kbPhage0-23kbCosmid~45kbBAC~100kbYAC~300kb-1.2Mb粘?？寺∷璧目寺∽訑?shù)是phage的一半，如需700000時(shí)，cosmid需350000個如無特殊需要(如單個phage不能包容靶基因片段或要分離一系列跨過染色體DNA特大區(qū)段的重疊克隆時(shí))一般不采用cosmid，因其在構(gòu)建文庫和貯存文庫比phage困難得多1．phagevectors早期（70年代后期）使用，如Charon4A和gt-WES，克隆15～20kb目前用EMBL系列,2001，DASH，Charon38-40，GEM-11等置換型載體，插入片段的最大值可達(dá)20-24kb·選擇載體要考慮的因素

易于從重組噬菌體中回收插入的外源DNA

易于制備兩臂

載體的可知性，如序列，圖譜

載體臂上的琥珀突變，利用特殊篩選系統(tǒng)

重組體中有活性的gam基因

載體臂上的chi序列2．Cosmidvector所有cosmidvector均可用于構(gòu)建文庫，但建議盡量使用pJB8和c2RB，因?yàn)榻?jīng)驗(yàn)較多，許多問題易于解決·載體臂的純化（梯度離心：蔗糖

或NaCl）

梯度離心的收獲量大，而agarose回收量小

回收無填充片段

聚乙二醇沉淀，除去碎片置換型載體coscosRLCentralstuffer3．基因組DNA的消化

一般采用Sau3AI消化

回收20-24kb（agarose法or梯度離心）

·有些載體可做不完全補(bǔ)平4．連接/包裝

連接形成較長的多聯(lián)體，包裝成粘粒（4℃6個月穩(wěn)定）5．?dāng)U增和保存重組phage可在E.coli中擴(kuò)增，所得文庫可被長時(shí)間利用和貯存，可用于多個不同基因的篩選6．在宿主菌上形成噬菌斑7．帶有目的外源DNA序列的phage重組體的鑒定8．對選出的重組phage進(jìn)行噬斑純化，再對外源DNA進(jìn)行分析

基因組DNA片段3’凹端的不完全補(bǔ)平-GATC--CTAG--GATC--CTAG-Sau3AI-GAGATC--CTAGAG-KlenowdATP/dGTP-CTCGAG--GAGCTC-XhoIKlenowdCTP/dTTP-CTCTCGAG--GAGCTCTC-互補(bǔ)GEM-11基因組DNAVector三、重組體的篩選和分析

噬斑原位雜交將噬菌體以一定密度鋪于平板，并影印到固相膜上要從哺乳動物DNA文庫里篩選出目標(biāo)基因，哺乳動物基因組復(fù)雜度為3×109bp，必須篩選幾十萬個噬斑不同大小的培養(yǎng)皿所能容納的噬斑數(shù)目四、亞基因組文庫的構(gòu)建用基因組DNA的特定部分所構(gòu)建的基因文庫質(zhì)粒DNA，線粒體DNA,特定限制性片段在有雜交探針的情況下，可通過Southern雜交，先找出目標(biāo)基因所在的限制性片段的大小，然后用相應(yīng)大小的限制性DNA片段構(gòu)建出基因文庫，這樣可減少篩選的壓力。例如

將基因組DNA用多種限制性內(nèi)切酶切割，

通過Southern雜交

則

將SpeI切割的基因組DNA中的~8.3kb片段回收，用于構(gòu)建DNA文庫發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因在8.3kbSpeI片段上一、cDNA克隆用的mRNA第二節(jié)cDNA文庫的構(gòu)建2．mRNA的豐度

高豐度mRNA

珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白

在特定細(xì)胞中占50-90%

低豐度mRNA0.5%被稱為低豐度或稀有mRNA文庫應(yīng)足夠大，鑒定和分離困難3．mRNA的富集

按大小對mRNA進(jìn)行分級分離

分離不同大小的mRNA（先變性，如氫氧化甲基汞，后梯度離心，蔗糖）

體外翻譯，檢測每份中的比活

cDNA的分離級分離近年來多采用此方法，特別是大mRNA，可避免降解mRNA,agarose分離大小易辯

多聚核糖體的免疫學(xué)純化法用抗體來純化合成的目的多肽的多聚核糖體·

免疫親和柱/A蛋白-Sepharose柱，單克隆抗體把正在合成新生鏈的多聚核糖體結(jié)合到A蛋白-spharose柱上，隨后用EDTA解離下來，通過oligo(dT)層析分離mRNA?！?/p>

此法分離的mRNA只占總mRNA的0.01-0.05%·

并非都可用，根據(jù)材料\來源\特異性來選擇

反轉(zhuǎn)錄酶

AMV(42℃)M-MuLV(37℃)

RNaseHRNaseH弱

長mRNA

引物

oligo(dT)12-18

一般要求濃度高

模板

氫氧化甲基汞預(yù)處理，減弱鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)

RNase

抑制劑AAAAAAAmRNA5'3'TTTTTTTT二、cDNA第一鏈的合成cDNA1．自身引導(dǎo)法三、cDNA第二鏈的合成2.置換合成法

有效

無須進(jìn)一步純化

不需用S1酶，否則會導(dǎo)致cDNA的大量損失問題：

如何脫帽以便進(jìn)入載體

5’端cDNA不能合成（少幾個Nt）

有可能仍形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)3.第二鏈引導(dǎo)合成Okayama-Berg方法4.引物-銜接頭合成法四、dscDNA的分子克隆1.同聚物加尾問題：

只對質(zhì)粒有效，文庫不易保存和復(fù)制。

尾的長短不一

(100dA/dT,20dG/dC)

同聚尾結(jié)合的質(zhì)粒：cDNA雜合分子轉(zhuǎn)化E.coli的效率隨宿主不同而不同。2．合成接頭和銜接頭cDNA合成接頭(含酶切位點(diǎn))酶切NotI,SalI與載體連接Optional:methylation

接頭中含稀有位點(diǎn)，如NotI,SalI(100kb一次)先甲基化ds

cDNA，再連接接頭用銜接頭替換接頭用銜接頭替換接頭3.其他方法(1)mRNA-cDNA雜交體克隆mRNAcDNAAAAAAAAARNA末端加尾效率只及DNA的1/10合成第一鏈后,加尾,與帶dT尾的載體退火,在宿主體內(nèi),可除去RNA,代之以DNA優(yōu)點(diǎn):無須合成第二鏈,序列完整

但效率<1/10(2)依次連加不同接頭(3)RACErandomamplificationofcDNAendscDNA克隆是常出現(xiàn)丟失末端序列的現(xiàn)象，需較長時(shí)間獲得全長cDNA克隆

篩選文庫時(shí)一般只能回收一個或幾個cDNA克隆，

而RACE可產(chǎn)生大量獨(dú)立克隆mRNAcDNATTTTTTTT-QI-QOAAAAAAAA.經(jīng)典RACE3‘末端克隆TTTTTTTT-QI-QO反轉(zhuǎn)錄QOPCRGSP1QIGSP2根據(jù)已經(jīng)得到的不完整的cDNA的序列設(shè)計(jì)引物GSP1和GSP2PCRcDNA克隆中,得到了不完整的片段,可采用此方法獲得3‘末端和5’末端的序列5‘末端克隆mRNAAAAAAAAGSP1GSP1AAAAAQ1-Q2-TTTTTTQ1/GSP1PCR反轉(zhuǎn)錄Q2/GSP2PCRGSP2獲得的cDNA克隆片段AAAAAAAGSP1反轉(zhuǎn)錄連接RNA寡聚物NNNNNNNNB.新RACE(4)其他與cDNA第二鏈合成有關(guān)的方法，如

Okayama-Berg方法和引物-銜接頭合成法五、cDNA克隆用的載體1．gt10和gt11gt10:可用核酸探針

克隆0-6kbEcoRI插入后載體變cI-cI+在hflA中發(fā)生溶原GenBank:U02447gt11：表達(dá)載體，可用免疫探針

克隆0-7.2kb可表達(dá)融合蛋白LacZE.coli

C600allowinggrowthofparentalandrecombinantphageC600hflrepressesparentalphagegrowth50-100-fold,recombinantphageformclearplaquesandparentalphageformturbidplaquesE.coli

LE392allowinggrowthofparentalandrecombinantphageY1090asthehost,42C形成噬斑適合用免疫學(xué)探針篩選2.ORF89kb可用于定向克隆3．其它gt18，19，20，21，22，23，ZAP第三節(jié)

基因克隆的策略基因克隆的本質(zhì)從文庫中篩選目標(biāo)克隆，重點(diǎn)在“篩選”常見篩選工具:探針狹義:核酸,抗體廣義:還包括其他篩選手段抗性基因:antibiotics抗性基因,抗重金屬活性一、功能篩選

分解基因:苯環(huán)化合物,分解酶

功能活性：殺蟲，酶

啟動子/復(fù)制子利用目標(biāo)基因的特定功能進(jìn)行篩選AmporiMCSTetgenewithoutpromoterVector將目標(biāo)DAN切割成小片段,插入MCS在Tet平板上篩選抗性菌落,可得到promoter其他標(biāo)記:gfp,Kan質(zhì)粒復(fù)制單位的克隆AmporiMCS目標(biāo)宿主可用的抗性gene將目標(biāo)DAN切割成小片段,插入MCS在抗性平板上篩選抗性菌落,可得到質(zhì)粒復(fù)制單位

功能缺失在獲得相應(yīng)突變體的前提下以此突變體作為宿主在野生型的DNA導(dǎo)入后檢測回復(fù)突變?nèi)?/p>

營養(yǎng)缺陷型

相關(guān)的基因二、核酸探針

同源DNA探針高度保守的基因rRNA基因鄰近種屬的相應(yīng)基因相應(yīng)基因的序列比較

合成寡核苷酸蛋白質(zhì)N-末端aa序列簡并探針degeneracy選取簡并程度低的aa序列

綜合合成可能的話

設(shè)計(jì)一對,用PCR產(chǎn)物作探針根據(jù)密碼子的使用頻率,合成猜測體探針設(shè)計(jì)兩組簡并探針,用第二個探針對第一次篩選的陽性克隆子作第二次雜交三、免疫在可獲得PT后,制備抗體,用于篩選四、高表達(dá)基因高豐度mRNA,如

用苯肼作了貧血處理的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞中,血紅蛋白mRNA的含量占絕大多數(shù)五(1)、差別雜交五(2)、扣除雜交Tcell(TCR)BcellmRNAmRNAcDNAcDNA:mRNA雜交體過量通過羥基磷灰石柱,吸附雜交分子Tcell(TCR)特異的cDNA流出cDNA第二鏈合成生物素標(biāo)記生物素結(jié)合蛋白柱六、mRNA差別顯示mRNA3’末端

有12中可能的序列以此12種引物引導(dǎo)cDNA第一鏈合成引物:5‘-T11MN或5‘-T12MN

M=A,G,orC以10核苷酸隨機(jī)引物引導(dǎo)cDNA第二鏈合成(PCR)

可產(chǎn)生50-100條100-500bpDNA條帶12種錨定引物和20種隨機(jī)引導(dǎo)組成240組引物,產(chǎn)生約20000DNA條帶Sequencinggel`對兩個相近品種的mRNA作上述處理,比較它們產(chǎn)生DNA擴(kuò)增條帶的差異,找到

單方具有的特異DNA條帶,則可能找到特異性表達(dá)的基因,回收并克隆特異性的條帶,分析其序列,以此條帶為探針克隆全長基因。七、酵母雙雜交系統(tǒng)用于分離與某一已知蛋白發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)基因GAL4