新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測標準操作規(guī)程

新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測標準操作指導書操作步驟試劑準備區(qū)進行取出-20℃保存的試劑盒，并將試劑盒批號、過期日期等信息記錄在《PCR檢測記錄表》上,從試劑盒取出2019-nCoV反應液，解凍，上下顛倒混勻后，點動離心；取X個0.2mlPCR八連管（X=樣本數(shù)目，包括質控品數(shù)量）放在PCR管架上。將PCR反應液分裝至八連管中，每管分裝20μl（17ulNC(ORFlab/N)反應液A和3ulNC(ORFlab/N)反應液B），蓋好所有的PCR管蓋，通過傳遞窗傳送至標本制備區(qū)進行加樣。剩余部分要在試劑盒上標記：開啟人、開啟日期和剩余人份。新冠病毒RNA的提取新冠病毒RNA的提取1.2.1.1將室溫放置96孔試劑板顛倒3次，去除塑封膜后在96孔板離心機中短暫離心（或手甩），避免掛液。撕去96孔試劑板上的鋁箔膜，確認板子方向（磁珠在第6/12列）。1.2.1.2在96孔板的第1及第7列孔中加入200μL樣品，避免交叉污染。1.2.1.3將96孔板放入Smart32核酸提取儀中，裝上磁棒護套。1.2.1.4按以下程序進行自動化提取實驗：1.2.1.5自動化程序結束后，將第6及第12列的洗脫液轉移至干凈的無核酸酶離心管中；如不馬上使用，請將洗脫液轉移至新的1.5mL無核酸酶離心管中，零下20度保存。PCR擴增在樣本制備區(qū)的生物安全柜中進行加樣操作，并使用干凈的手套進行實驗操作。取出提取的RNA保存離心管，擺放在1.5ml離心管架上，若經過冷凍處理，則需進行解凍，振蕩混勻后進行點動離心。根據(jù)RNA上的編號對準備好的PCR混合液進行編號。打開PCR管蓋，分別用干凈的濾芯槍頭加入5uL對應編號的樣本RNA至PCR混合液中。每一次實驗需要同時擴增三個陰性質控（1份生理鹽水，2份陰性樣本）和1個弱陽質控。加完模板的槍頭應小心打入廢液缸中，并確保移液器前臂沒有碰到廢液缸口。加完所有模板后，仔細核對加樣順序與編號是否正確，確保每個反應管的加樣無誤。確定每個八連管的蓋子蓋緊后，在微型離心機上進行點動離心去氣泡（或在擴增區(qū)微型離心機上進行），并通過傳遞窗傳送至擴增區(qū)進行擴增。以達安AGS4800定量PCR操作為例：打開程序軟件，按樣本對應順序設置空白質控品、陰性質控品、陽性質控品以及未知樣本；探針檢測模式設置為：Reporter1：FAM，Quencher1：NONE；Reporter2：VIC，Quencher2：NONE；Reporter3：Cy5，Quencher3：NONE將八連管放入PCR儀中，整體按壓管蓋使其壓緊，在《48孔板工作表》記錄每個樣本在PCR儀上的位置，確認程序正確并已啟動后，實驗人員方可離開，進行PCR反應。室內質控質控品來源名稱來源陰性質控留樣生理鹽水外購陽性質控第三方質控室內質控方法每個批次標本的檢測均需有留樣檢測、生理鹽水及陽性對照參與提取-擴增的全過程，全程操作同標本的處理。只有連續(xù)評價結果在控，本實驗室測定工作可靠，檢驗報告才可發(fā)出。失控判斷規(guī)則陰性質控品：FAM和（或）VIC檢測通道有明顯擴增曲線；Cy5通道無明顯擴增曲線；陽性質控品：FAM和VIC檢測通道任意一個或兩個通道無明顯擴增曲線；Ct值>32，Cy5通道有或無擴增曲線；空白質控品：任意一個通道或所有通道有明顯擴增曲線；以上規(guī)則任意一個滿足均為失控，需重新進行試驗。失控處理分析并填寫《失控分析報告》結果解釋結果判讀10.1.1.如果檢測樣品在FAM和VIC通道無擴增曲線或Ct值>40，且Cy5通道有擴增曲線，可判樣品未檢測到2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）RNA；10..1.2.如果檢測樣品在FAM和VIC通道Ct值≤40，且有明顯的擴增曲線，可判樣品為2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）陽性。10.1.3.如果檢測樣品僅在FAM或VIC單一通道Ct值≤40，另一通道無擴增曲線，結果需復檢，復檢結果仍為單通