植物轉(zhuǎn)錄組國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展

植物轉(zhuǎn)錄組國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展摘要：植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門(mén)新興學(xué)科，通過(guò)提取植物中mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，隨后建立cDNA文庫(kù)并利用近幾年興起的RNA-seq高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行分析，以揭示植物細(xì)胞內(nèi)整體水平的基因表達(dá)狀態(tài)和基因結(jié)構(gòu)信息，從而深刻理解植物組織基因型和表型之間的相互關(guān)系，以及在分子水平上弄清楚基因和功能表達(dá)之間的聯(lián)系，對(duì)研究生物體作用機(jī)理的分子機(jī)制具有重要意義。本文主要介紹了植物轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的技術(shù)發(fā)展歷史、測(cè)序平臺(tái)比較、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)以及在植物上的應(yīng)用。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析工具的迅猛發(fā)展，植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)將面臨巨大挑戰(zhàn)和更廣闊的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)，RNA-seq，高通量測(cè)序技術(shù)，基因表達(dá)狀態(tài)，基因結(jié)構(gòu)信息TheProgressonPlantTranscriptomeResearchinChinaandAbroadAbstract:Asanewsubject,planttranscriptomeaimsatthegeneexpressionstatusandgenestructureinformationwithintheplantcell.ItneedsextractingmRNAinplantsforreversetranscriptionandestablishingcDNAlibrarytoanalyzeHighthroughputsequencetechnologyresults,whichrisesinrecentyears.Thus,wecouldhaveadeepunderstandingoftherelationshipbetweengenotypeandphenotypeinplanttissues,andtheclearlinksbetweengenesandtheirfunctionalexpressionsatthemolecularlevel.Itisofgreatsignificancetostudymolecularmechanismoftheactionsoforganisms.Inthisstudy,weillustratethedevelopmentofthetechnologyofplanttranscriptomesequencing,thecomparisonofthesequencingplatform,theadvantagesofthesequencingtechnologyandtheapplicationinplant.Withtherapiddevelopmentofhighthroughputsequencingtechnologyandbioinformaticsanalysestools,planttranscriptomeresearcheswillfacegreatchallengesandwideapplicationprospect.Keywords:planttranscription,RNA-seq,highthroughputsequencingtechnology,geneexpressionstatus,genestructureinformation基因組(Genome)，作為生物遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)，由成千上萬(wàn)的堿基組合而成，其含有生物的所有遺傳信息，通過(guò)測(cè)序可以獲得這些基因組的遺傳信息。雖然基因的表達(dá)由于受到某些激發(fā)子的誘導(dǎo)則不盡相同，但是近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展,使得對(duì)基因表達(dá)的研究變得容易,對(duì)兩個(gè)不同樣品差異表達(dá)基因的研究也得以開(kāi)展。轉(zhuǎn)錄組(Transcription)這一概念由VelculescuVE.等［1］首先提出，它是特定細(xì)胞或組織在特定發(fā)育階段或生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的集合。植物細(xì)胞具備特定的空間性和時(shí)間性⑵，即同一細(xì)胞在不同的生長(zhǎng)階段及生長(zhǎng)環(huán)境下，基因的表達(dá)情況是存在差異的，故轉(zhuǎn)錄組可對(duì)植物不同組織或不同生

理狀態(tài)下差異表達(dá)基因進(jìn)行研究和探討，進(jìn)而發(fā)掘與特定生理功能相關(guān)的基因、轉(zhuǎn)錄本SNP以及各種分子標(biāo)記等基因資源,將利于研究人員對(duì)非模式生物的遺傳信息有全面深刻的了解。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門(mén)在整體水平研究轉(zhuǎn)錄組，即某一階段特定組織或細(xì)胞中全部轉(zhuǎn)錄本的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)、功能以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的科學(xué)［3］，能夠通過(guò)研究大規(guī)?；虮磉_(dá)的分析來(lái)揭示參與特定生命過(guò)程的基因及這些基因的狀態(tài)變化，即從RNA水平上研究基因表達(dá)情況。對(duì)同一樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可獲得低表達(dá)量基因，而對(duì)不同樣品進(jìn)行同時(shí)測(cè)序可以獲得樣品之間的差異表達(dá)基因。對(duì)有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究可以獲得轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度、差異表達(dá)基因、轉(zhuǎn)錄發(fā)生位點(diǎn)、可變剪切位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄本SNP等重要生物學(xué)信息囹。而對(duì)于沒(méi)有參考基因組的物種，可以對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序reads片段進(jìn)行denovo(重新)組裝，從而獲得該物種的單拷貝基因序列集(unigenes)，對(duì)于研究物種的基因組和功能基因信息具有重要意義。1.轉(zhuǎn)錄組的高通量測(cè)序技術(shù)高通量測(cè)序技術(shù)是轉(zhuǎn)錄組學(xué)的主要研究方法。目前，用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的高通量測(cè)序技術(shù)主要有表達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetags,ESTs)、基因表達(dá)系列分析技術(shù)(Serialanalysisofgeneexpression;SAGE)、大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)(MassivelyparallelsignaturesequencingMPSS)、基因芯片(Microassay)及第二代高通量測(cè)序技術(shù)(RNA-Seq)。由于RNA-Seq測(cè)序技術(shù)能夠較為快速、準(zhǔn)確地為人們提供更多的生物體轉(zhuǎn)錄信息，故RNA-seq成為最新興起的利用深度測(cè)序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)，受到廣泛關(guān)注。它們的技術(shù)流程⑸如圖1-2所示?；蛐酒琑］AcDNA雜交|轉(zhuǎn)錄組基因芯片R］AcDNA雜交|轉(zhuǎn)錄組SAGER］AcgNA錨定酶IcDNA片段連接接頭帶接頭的cDNA片段標(biāo)簽酶柱標(biāo)簽連接、PCR1F雙標(biāo)簽錨定酶多連體MPSSRJAcDNA連接接頭J帶接頭的cDNA文庫(kù)T4聚合酶］dGTP單鏈cDNA文庫(kù)雜交、測(cè)序|轉(zhuǎn)錄組RNA-seqRNAIcDNAIcDNA片段PCR]cDNA文庫(kù)測(cè)序Y轉(zhuǎn)錄組圖1-1不同高通量測(cè)序平臺(tái)比較［25,26］1.1表達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetags,ESTs)表達(dá)序列標(biāo)簽，是通過(guò)隨機(jī)挑選cDNA文庫(kù)進(jìn)行單向測(cè)序得到的序列，長(zhǎng)度一般在60-500bp,并且攜帶有表達(dá)基因的部分遺傳信息［6］。該技術(shù)是最早用來(lái)研究轉(zhuǎn)錄組的方法，因具有快速、高效、信息含量大和通用性好等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛運(yùn)用到植物表達(dá)譜研究⑺、構(gòu)建遺傳學(xué)圖譜㈤、“電子”基因克隆、基因表達(dá)研究［9］以及分子遺傳標(biāo)記(單核苷酸多態(tài)性、簡(jiǎn)單序列重復(fù)片段和限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性等分子標(biāo)記)［10-12］中。1.2基因表達(dá)系列分析技術(shù)(SAGE)和大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)(MPSS)SAGE是基于短序列測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組研究方法，是Velculescu等［13］在1995年首次建立的一種高通量、高效、快速分析基因表達(dá)譜的開(kāi)放性差異基因表達(dá)技術(shù)。該技術(shù)無(wú)須知道物種的基因組信息，便能夠整體地檢測(cè)所有轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，這對(duì)發(fā)現(xiàn)低拷貝基因有著重要意義USSAGE現(xiàn)已成功地應(yīng)用于植物及病原真菌等研究領(lǐng)域。例如美國(guó)科學(xué)家于2000年研究了大豆功能基因組學(xué)，其目的在于開(kāi)發(fā)可用于大豆全基因表達(dá)分析的有力工具，將SAGE與微列陣相結(jié)合,以獲得大豆不同組織、不同發(fā)育階段以及不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)［15］°MitchellU6］等人2003年利用SAGE技術(shù)對(duì)水稻與稻瘟病菌之間相互識(shí)別及病理反應(yīng)進(jìn)行全基因組分析，旨在了解與病原菌致病力和寄主抗性相關(guān)的基因，并從病菌中確定那些與植物互作相關(guān)的蛋白質(zhì)，創(chuàng)建了50000個(gè)隨機(jī)產(chǎn)生的病菌突變體，以求確定與復(fù)制和致病力有關(guān)的基因。水稻和稻瘟病基因組序列的公布，為闡明水稻和稻瘟病互作的分子機(jī)制創(chuàng)造了便利條件?；赟AGE技術(shù)的改進(jìn)，大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)(massivelyparallelsignaturesequencing,MPSS)由Brenner等［17］2000年建立，成為一種新型基因克隆技術(shù)，可以獲得更長(zhǎng)的短標(biāo)簽序列，從而提高轉(zhuǎn)錄本的精準(zhǔn)確度。另外，MPSS技術(shù)特有的微球熒光測(cè)序還可以直接高通量讀出序列［18,19］。并且它還是一個(gè)數(shù)字表達(dá)系統(tǒng)，不必預(yù)先知道基因的序列，就能夠在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到細(xì)胞或組織內(nèi)幾乎所有基因的轉(zhuǎn)錄情況，尤其對(duì)那些表達(dá)水平較低、差異較小的基因非常有效，被認(rèn)為是功能基因組研究的有效工具。但是,這兩種技術(shù)過(guò)程中包含了酶切、克隆或雜交等繁瑣步驟，這些步驟可能會(huì)導(dǎo)致序列出現(xiàn)堿基偏向性，從而影響轉(zhuǎn)錄本的正確性［20］。1.3基因芯片(Microassay)技術(shù)基因芯片是基于核酸雜交的一種轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)，其利用紅、綠熒光染料分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)樣本和對(duì)照樣本cDNA，混合后與基因芯片雜交，可顯示實(shí)驗(yàn)樣本和對(duì)照樣本基因的表達(dá)強(qiáng)度［21］。目前，基因芯片主要應(yīng)用于基因表達(dá)檢測(cè)、尋找新基因、DNA測(cè)序、基因突變、多態(tài)性分析及基因文庫(kù)作圖等方面研究。基因芯片技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是此法比較成熟，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)較高表達(dá)的基因。主要缺點(diǎn)是雜交背景高，受基因拷貝數(shù)的限制，無(wú)法檢測(cè)出低豐度基因；受數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)所限，可能出現(xiàn)注釋錯(cuò)誤。1.4數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)(DGE)1997年，Audic和Claveriet22!首次提出了數(shù)字基因表達(dá)譜(digitalgeneexpressionprofiling，DGE)技術(shù)，其以高通量測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)，對(duì)標(biāo)簽直接進(jìn)行測(cè)序，再將標(biāo)簽轉(zhuǎn)化為數(shù)字化信號(hào)來(lái)反映基因的表達(dá)量［23］，能夠全面、經(jīng)濟(jì)、快速地檢測(cè)某一物種特定組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)情況。具有如下優(yōu)勢(shì)：信息數(shù)字化、能夠檢測(cè)未知基因的表達(dá)、能統(tǒng)計(jì)單拷貝及單堿基差異的標(biāo)簽以及發(fā)現(xiàn)新基因等。在黃瓜的水澇逆境分析中，QI等［24］采用DGE技術(shù)研究0h、2h、4h、8h和24h這5個(gè)時(shí)間點(diǎn)黃瓜根部的基因表達(dá)譜，其中主要參與碳代謝，光合作用，活性氧的產(chǎn)生/去除等方面的基因都有較大的差異表達(dá)，這將在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)對(duì)黃瓜應(yīng)答水澇脅迫的復(fù)雜機(jī)制的了解。1.5第二代高通量測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)1.5.1第二代高通量測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介以雙脫氧終止法核酸技術(shù)(Sanger技術(shù))為代表的第一代測(cè)序技術(shù)完成了人類(lèi)基因組的繪制，此法在測(cè)序長(zhǎng)度(可達(dá)1000bp)和堿基準(zhǔn)確率(高達(dá)99.999%)有著明顯的優(yōu)勢(shì)，但因其實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，花費(fèi)大和測(cè)序通量低,并不能滿(mǎn)足在大規(guī)模測(cè)序中應(yīng)用的需求t25-27］。隨著生命科學(xué)的發(fā)展進(jìn)入后基因組時(shí)代，應(yīng)運(yùn)而生的是新一代RNA-Seq技術(shù)(RNA-sequencing)，它可同時(shí)對(duì)數(shù)十萬(wàn)乃至數(shù)百萬(wàn)條DNA進(jìn)行測(cè)序，被稱(chēng)為高通量測(cè)序；也可用于轉(zhuǎn)錄本研究，即檢測(cè)總RNA或mRNA的技術(shù)，全面、深入和細(xì)致地分析一種生物的組織或細(xì)胞的基因組、轉(zhuǎn)錄組，因此又被稱(chēng)為深度測(cè)序［28］。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)是一種是指建立在新一代Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)(/systems/genome_analyzer.ilmn)基礎(chǔ)上的cDNA測(cè)序新興技術(shù)，最初由BrianT.Wilhelm的研究團(tuán)隊(duì)［29］和UgrappaNagalakshmi的研究團(tuán)隊(duì)［3。］分別在《nature》雜志和《science》雜志發(fā)表了利用RNA-Seq技術(shù)闡述裂殖酵母(fissionyeast)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)轉(zhuǎn)錄組的研究論文，標(biāo)志著RNA-Seq技術(shù)的建立。RNA-Seq技術(shù)的建立，極大地推動(dòng)了許多非模式植物、農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物的全基因組測(cè)序工作。其首先是將所有的mRNA分子反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行測(cè)序得到大量reads，將這些reads進(jìn)行拼接后與參考基因組比對(duì)，進(jìn)而推斷轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達(dá)情況。此技術(shù)能在單核苷酸水平對(duì)特定物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)［30］,從而全面快速地獲得該物種在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本信息。該測(cè)序技術(shù)被認(rèn)為是一種在轉(zhuǎn)錄水平上更為精確的測(cè)定分析方法，在轉(zhuǎn)錄組學(xué)的應(yīng)用上具有革命性意義［31］。最具代表性的測(cè)序技術(shù)平臺(tái)有:Roche454焦磷酸測(cè)序技術(shù)、IlluminaSolexa聚合酶合成測(cè)序技術(shù)和ABISOLiD連接酶測(cè)序技術(shù)。在植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，因RNA-Seq技術(shù)速度快、成本低、測(cè)序度深和產(chǎn)出量大等特點(diǎn)，有力地支持和推動(dòng)了植物分子生物學(xué)的研究。相較傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)（EST、MPSS、基因芯片）而言，RNA-Seq因具有高通量、低成本、對(duì)物種遺傳背景和靈敏度要求較低，重復(fù)性好，精確度高，且不需要太大的RNA量，可檢測(cè)到低至幾個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)錄本等特點(diǎn)，從而表現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)越性，故逐步代替上述測(cè)序技術(shù)而成為轉(zhuǎn)錄組研究的主要方法［32-34］。由于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以得到RNA轉(zhuǎn)錄本的豐度信息，且還可以比較不同組織和不同時(shí)空條件下基因的表達(dá)差異，推斷相應(yīng)未知基因的功能，或補(bǔ)充已知基因的功能，揭示特定調(diào)節(jié)基因的作用機(jī)制，更深入地了解該生物體基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理，這使它具有十分廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，包括檢測(cè)新的轉(zhuǎn)錄本（未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本）、分析不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平差異,確定表達(dá)量、非編碼區(qū)域功能研究（非編碼RNA研究、微小RNA前體研究等）、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究、基因轉(zhuǎn)錄水平研究等方面。454SOLiDSolexa開(kāi)發(fā)商 RocheABIIllumina技術(shù)原理焦磷酸酸測(cè)序基于磁珠的大規(guī)模邊合成邊測(cè)序并行連接測(cè)序單次運(yùn)行時(shí)間 10小時(shí)7天5-7天產(chǎn)量 600M100G360G獲得1M^的費(fèi)用60美元2美元2美元

平均讀長(zhǎng)450bp50bp150bp準(zhǔn)確率>99%可達(dá)99.94%可達(dá)98.50%平均讀長(zhǎng)450bp50bp150bp準(zhǔn)確率>99%可達(dá)99.94%可達(dá)98.50%雙向測(cè)序Pair-end圖1-2轉(zhuǎn)錄組高通量平臺(tái)技術(shù)流程［5］1.5.2轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)優(yōu)勢(shì)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是首先建立cDNA文庫(kù)，然后利用Sanger法進(jìn)行測(cè)序。相對(duì)于傳統(tǒng)的cDNA文庫(kù)測(cè)序方法，新一代的基于高通量的RNA測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）,能夠經(jīng)濟(jì)快速地得到大量轉(zhuǎn)錄組信息，從而研究基因表達(dá)譜?；诟咄繙y(cè)序的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)具有以下諸多優(yōu)勢(shì)：（1）測(cè)序覆蓋度高：檢測(cè)到的信號(hào)是數(shù)字化信號(hào)，幾乎能夠覆蓋所有的轉(zhuǎn)錄本；（2）檢測(cè)精度高：能夠產(chǎn)生幾十到幾十萬(wàn)個(gè)拷貝精確計(jì)數(shù)；（3）分辨率高：?jiǎn)位虿町?，基因家族中相似基因及可變剪切造成的不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)都能夠檢測(cè)到；（4）不受研究物種限制,對(duì)任意物種的全基因組分析：不用預(yù)先設(shè)計(jì)特異性探針，所以在不了解物種基因信息的情況下就可以直接對(duì)任意物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，同時(shí)能夠檢測(cè)未知基因、發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本、精確地識(shí)別可變剪切位點(diǎn)及cSNP和UTR區(qū)域；（5）不受基因表達(dá)水平限制，高低豐度基因均能檢測(cè)，且對(duì)稀有轉(zhuǎn)錄本和正常轉(zhuǎn)錄本同時(shí)進(jìn)行鑒定和定量分析；（6）重復(fù)性高：不需要技術(shù)重復(fù)，單次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)就可以提供全面的轉(zhuǎn)錄組信息；（7）數(shù)據(jù)量比基因芯片多出約25%，而且數(shù)據(jù)能直接用于基因芯片分析軟件，實(shí)現(xiàn)兩種技術(shù)數(shù)據(jù)的無(wú)縫銜接等優(yōu)勢(shì)①］。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，應(yīng)用廣泛，基于其研究的優(yōu)勢(shì)與可實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)，很多研究領(lǐng)域包括營(yíng)養(yǎng)、發(fā)育階段、病原物、非生物脅迫等均開(kāi)展了轉(zhuǎn)錄組分析，這些對(duì)于（1）獲得物種或組織的轉(zhuǎn)錄本信息；（2）獲得轉(zhuǎn)錄本上基因的相關(guān)信息；（3）新基因的發(fā)現(xiàn)；（4）基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化；（5）發(fā)現(xiàn)可變剪切；（6）發(fā)現(xiàn)基因融合；（7）進(jìn)行基因表達(dá)差異分析等［36-39］均具有促進(jìn)作用。2.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的一般流程轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程(圖1.1)：2.1文庫(kù)的構(gòu)建首先將樣品中總RNA抽提出來(lái)并進(jìn)行DNaseI消化，真核生物用Oligo(dT)法富集mRNA，原核生物用試劑盒去除rRNA；將mRNA打斷成短片段，以打斷成200bp的片段后的mRNA為模板合成一鏈cDNA，然后合成二鏈cDNA，加接頭，進(jìn)行片段大小篩選，PCR擴(kuò)增后制成Library。2.2測(cè)序過(guò)程構(gòu)建好的文庫(kù)質(zhì)檢合格后，使用IlluminaHiSeq2000或其他測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)是邊合成邊測(cè)序，在每個(gè)循環(huán)過(guò)程中，四種熒光標(biāo)記的核苷酸被加入到單分子陣列中，通過(guò)被加入到序列的核苷酸發(fā)出不同顏色的熒光，從而來(lái)判斷序列的信息。2.3數(shù)據(jù)分析測(cè)序后得到大量的序列信息，與其在初始模板中的濃度成正比，因此進(jìn)行測(cè)序后需要使用強(qiáng)大的生物信息學(xué)手段對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次分析。圖1,1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序步驟1■'華大轉(zhuǎn)錄組測(cè)序報(bào)告】FigL1Transcriptomesequencingstep3.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在植物上的應(yīng)用3.1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在植物上的應(yīng)用與傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)相比,RNA-Seq技術(shù)測(cè)序通量高、時(shí)間短且成本低、信息量大，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)錄組的研究中。其中，在玉米、水稻、大豆、大麥、葡萄等植物上取得重要研究進(jìn)展。朱曉鋒［40］采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建馬尾松均一化cDNA文庫(kù)，對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，經(jīng)EST序列拼接獲得了83680個(gè)contig（重疊群），其中10647個(gè)contig被注釋具有酶功能且關(guān)聯(lián)到135條生物學(xué)通路。此項(xiàng)結(jié)果將利于挖掘大量馬尾松生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的重要基因，進(jìn)一步研究功能基因組。RuthGrene采用RNA-seq方法分析了玉米抗旱轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)譜［41］。研究發(fā)現(xiàn)：在玉米子房中，應(yīng)答干旱脅迫的基因要多于葉分生組織，且參與細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期的基因轉(zhuǎn)錄本豐度大大下降。Li等人［42］對(duì)不同發(fā)育階段的玉米葉片進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因占64%，并且對(duì)玉米轉(zhuǎn)錄組的聚類(lèi)分析，也將為了解光合作用的系統(tǒng)生物學(xué)方法提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。翟榮榮［43］通過(guò)對(duì)超級(jí)稻在分蘗期和抽穗期的材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，產(chǎn)生約3.91億條reads，其中42081個(gè)轉(zhuǎn)錄本得到注釋?zhuān)硗忤b定到9325個(gè)SNP位點(diǎn)，此研究結(jié)果將為挖掘可能與根系發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因及深入研究雜種優(yōu)勢(shì)遺傳機(jī)制奠定基礎(chǔ)。Zhang等［44］采用RNA-seq方法對(duì)水稻轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了全面測(cè)序，以此來(lái)研究水稻愈傷組織、根尖組織、莖尖組織及稻穗組織等的基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了7232個(gè)低豐度表達(dá)并具有組織特異性的新轉(zhuǎn)錄本及23800個(gè)可變剪接，為研究復(fù)雜的水稻轉(zhuǎn)錄機(jī)制提供了廣泛的數(shù)據(jù)依據(jù)。張樂(lè)等［45］采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究了大豆核基因密碼子的使用偏好性，發(fā)現(xiàn)密碼子使用偏好性隨編碼區(qū)長(zhǎng)度的增加而降低，且在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，編碼區(qū)長(zhǎng)度介于400-600bp的基因表達(dá)水平最高，為運(yùn)用基因工程技術(shù)提高改良大豆提供理論依據(jù)。魏利斌等［46］對(duì)芝麻發(fā)育轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了高通量測(cè)序測(cè)序分析，獲得了大量在芝麻生長(zhǎng)發(fā)育及籽粒形成過(guò)程中有重要功能的基因，揭示了芝麻發(fā)育轉(zhuǎn)錄組的整體表達(dá)特征。在該研究中，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的重頭組裝，共獲得26837個(gè)基因，通過(guò)GO分類(lèi)和COG分類(lèi)分別對(duì)21863（81.46%）和12181（45.39%）個(gè)基因進(jìn)行了功能注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)這些基因主要富集在物質(zhì)及能量代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及防衛(wèi)反應(yīng)等諸多生理生化過(guò)程。ZhenLi［47］等人采用RNA-Seq技術(shù)，比較了黃瓜10個(gè)不同組織部位的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，并對(duì)8700個(gè)蛋白編碼基因進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化，共發(fā)現(xiàn)新基因5285個(gè)。本研究結(jié)果顯示，RNA-Seq技術(shù)能夠大大提高黃瓜基因組的蛋白編碼基因預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，從而促進(jìn)蛋白編碼基因的功能注釋。Zenoni等［48］運(yùn)用高通量Illumina轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究了葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程的轉(zhuǎn)錄組。通過(guò)分析所得數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了28個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的新基因和53個(gè)Glutathiones-transferase（GST，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶）家族的新基因，并鑒定出85870個(gè)SNP。熊麗東［49］通過(guò)使用Illumina的Solexa測(cè)序技術(shù)分別對(duì)紅花種子、葉片和花這三個(gè)部位進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析,最終獲得了紅花這三個(gè)部位的差異表達(dá)基因。在此基礎(chǔ)上，共有11,010條unigenes比對(duì)到了COG數(shù)據(jù)庫(kù),其中有1422條unigenes涉及到轉(zhuǎn)錄，翻譯后修飾，重組和修復(fù)，并獲得了油體蛋白全長(zhǎng)序列。為功能基因挖掘、藥用植物活性成分的生物合成與調(diào)控提供了新的思路和方法。在植物與病原菌互作研究領(lǐng)域，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種作物的病害研究。在葡萄(VitisVinifera)葉片的霜霉病菌(Plasmopamviticola)侵染的脅迫研究中，Wu等［50］借助Solexa測(cè)序技術(shù)，分析了病菌侵染4-8d后的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜，結(jié)果獲得了15,249個(gè)候選的差異表達(dá)基因。該研究對(duì)葡萄響應(yīng)霜霉病菌侵染的的早期防治有重要意義。Strau［51］等利用RNA-Seq技術(shù)，從辣椒(Capsicumannuum)材料中，分離鑒定到1個(gè)抗黃單胞菌桿菌(Xanthomonasvesicatoria)的基因Bs4C，該基因能夠調(diào)控對(duì)黃單胞菌類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)蛋白AvrBs4的識(shí)別，并且研究人員發(fā)現(xiàn)，通過(guò)RNA-Seq方法可以從農(nóng)作物的大量基因組中克隆出轉(zhuǎn)錄激活抗性基因，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)抗性育種提供新方法。人們對(duì)水稻的逆境脅迫也有研究。李湘龍等［52］利用Solexa技術(shù)，探究了早期(接種36h)稻瘟菌(Magnaporthegriisea)侵染的水稻的基因表達(dá)譜，通過(guò)分析，共鑒定到779個(gè)稻瘟菌預(yù)測(cè)基因，其中有42個(gè)為預(yù)測(cè)的分泌蛋白基因，為克隆稻瘟菌無(wú)毒基因提供了新途徑。研究發(fā)現(xiàn)，第二代測(cè)序技術(shù)成為克隆早期稻瘟菌侵染水稻時(shí)特異表達(dá)基因，尤其是克隆分泌蛋白基因的可行手段之一，為探究稻瘟病菌效應(yīng)蛋白基因及其功能提供探索。3.2轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究在藥用植物中的應(yīng)用作為藥用植物功能基因組研究的重要手段，高通量測(cè)序技術(shù)在其功能基因的發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮著重要作用。因RNA-Seq技術(shù)具備高通量、精確性高、低成本、敏感度高等優(yōu)點(diǎn)，加之其可檢測(cè)表達(dá)量較低的稀有轉(zhuǎn)錄本，及不依賴(lài)物種基因組信息，這對(duì)于藥用植物等非模式生物的研究尤為重要。目前，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序方法研究非模式藥用植物的報(bào)道如涌而至。Yuan等［53］運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)金銀花及其變種的三個(gè)不同階段的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，得到了金銀花不同花期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)圖譜，極大地推動(dòng)了金銀花質(zhì)量的研究及其藥效的評(píng)估。郝大成等［54］從中藥植物虎杖根轉(zhuǎn)錄組中挖掘出18個(gè)可能參與糖苷類(lèi)次級(jí)代謝物生物合成的尿苷二磷酸-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，以此探討了虎杖的功能基因組。另外研究還發(fā)現(xiàn)從組裝并得到注釋的86418個(gè)Unigene中發(fā)現(xiàn)1286個(gè)SSRs。研究結(jié)果將有助于深度挖掘分子標(biāo)記等基因資源，從而促進(jìn)相關(guān)制藥業(yè)發(fā)展。Tang等［55］對(duì)羅漢果(Siraitiagrosvenori)2個(gè)不同成熟期的果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和表達(dá)譜分析，經(jīng)DGE分析鑒定出可能參與羅漢果苷生物合成的7個(gè)細(xì)胞色素P450(CYP450)基因和5個(gè)UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDPG)基因。本研究的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將為了解羅漢果中主要生物活性成分提供重要信息。Lin等［56］以銀杏葉片為材料研究其轉(zhuǎn)錄組學(xué),獲得可能參與銀杏內(nèi)酯生物合成的26條編碼14個(gè)關(guān)鍵酶的基因,78個(gè)參與銀杏黃酮合成的10編碼個(gè)關(guān)鍵酶基因,并發(fā)現(xiàn)了多個(gè)編碼與抗病及防御相關(guān)的基因。本研究不僅為基于轉(zhuǎn)錄組的生物合成機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，而且顯著地促進(jìn)我們對(duì)非模式植物的功能基因組學(xué)及其發(fā)展的深入了解。Li等［57］利用454/RocheGSFLX對(duì)烏拉爾甘草進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,共獲得2.7萬(wàn)多個(gè)unigene，并發(fā)現(xiàn)了屬于甘草甜素生物合成途徑中的16個(gè)酶的基因，從而初步建立了甘草甜素生物合成途徑。李澄等據(jù)］通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)丹參轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，以期揭示丹參中生物合成途徑。在該研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)了13980條新的unigene，其中獲得223個(gè)SSR位點(diǎn)(1.22%)。丹參有效成分生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的發(fā)掘，將為進(jìn)行丹參及其同屬物種的基因組差異性分析、遺傳圖譜構(gòu)建等研究提供幫助。隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域的廣泛化，植物基因組研究隨之得到快速發(fā)展，而對(duì)藥用植物功能基因組的研究將有助于挖掘功能基因、探討藥用植物活性成分的生物合成與調(diào)控，從而促進(jìn)天然藥物的開(kāi)發(fā)，選育較優(yōu)良農(nóng)藝性狀的品種，這將使傳統(tǒng)中醫(yī)藥研究躋身于生命科學(xué)研究的前沿。3.3非生物脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在植物上的應(yīng)用由于轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以得到在不同條件或狀態(tài)下植物差異表達(dá)的基因，因此在植物抗逆以及病理學(xué)研究中也被廣泛應(yīng)用。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，可以加深對(duì)植物抗逆、抗病等分子機(jī)制的了解。目前，大量研究正試圖揭示這一復(fù)雜的生物學(xué)機(jī)制。非生物脅迫如干旱、高鹽、冷害、凍害、高溫、水澇等會(huì)影響植物水分、光合、呼吸、物質(zhì)代謝等過(guò)程，進(jìn)一步誘導(dǎo)植物相關(guān)基因的表達(dá)，最終積累某些物質(zhì)并改變其代謝途徑。而植物為了生存下來(lái)，在長(zhǎng)期的系統(tǒng)發(fā)育中逐漸形成了對(duì)逆境的眾多的適應(yīng)和抵抗機(jī)制，基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控則在其中發(fā)揮重要作用。研究非生物脅迫條件下植物的基因表達(dá)譜也已成為第二代測(cè)序技術(shù)的重點(diǎn)應(yīng)用領(lǐng)域。王剛?］通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)鹽脅迫處理前后的棉花幼苗開(kāi)展了研究，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下，參與不同信號(hào)通路的表達(dá)上調(diào)基因223個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因317個(gè)，其中約45%為未知新基因，推測(cè)這些基因在植物適應(yīng)鹽脅迫的過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)也揭示了鹽脅迫處理前后的棉花幼苗轉(zhuǎn)錄組水平的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。陳新［60］采用Solexa技術(shù)研究了寒冬時(shí)期平榛的花芽轉(zhuǎn)錄組，其中序列經(jīng)過(guò)拼接和組裝共有43285個(gè)Unigene得到注釋?zhuān)⒑Y選到數(shù)十條與冷調(diào)節(jié)相關(guān)的基因。此研究結(jié)果將為未來(lái)的榛子抗寒遺傳改良提供重要的基因資源。王洋［61］采用IlluminaSolexa測(cè)序技術(shù)對(duì)鹽堿地環(huán)境條件下的野生大豆根部進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究以及生物信息學(xué)分析,共獲得差異表達(dá)基因3380個(gè)。系統(tǒng)闡明了野生大豆鹽堿脅迫基因表達(dá)的調(diào)控規(guī)律，同時(shí)對(duì)植物耐鹽堿脅迫分子機(jī)制有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。江超W］采用Illumina測(cè)序技術(shù)，在對(duì)紫花苜蓿的研究中，測(cè)定了鹽脅迫下,0h、2h、4h和8h不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄組及表達(dá)譜，共獲得100.61M條的reads,20.32G的總堿基。本研究中所得的比較轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜可鑒別特定代謝過(guò)程中的差異表達(dá)基因。李玥［63］比較了低氮脅迫（LN）和正常對(duì)照（CK）下的燈盞花利用Illumina測(cè)序所得的轉(zhuǎn)錄組，探究了LN和CK的基因表達(dá)水平變化。最終得到條101,156個(gè)Unigene，發(fā)現(xiàn)91,908個(gè)差異基因表達(dá)，其中69,820個(gè)表達(dá)上調(diào)，22,088個(gè)表達(dá)下調(diào)。另外，經(jīng)過(guò)denovo組裝，在GO數(shù)據(jù)庫(kù)、KOG/COG數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中分別有72.88%、37.73%和37.61%的Unigene得到注釋?zhuān)⑶疫@些被注釋的基因主要涉及類(lèi)黃酮合成途徑。高通量測(cè)序成為闡明生理和表觀機(jī)制強(qiáng)有力工具。轉(zhuǎn)錄調(diào)控是植物應(yīng)答逆境脅迫的關(guān)鍵步驟，而在植物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子則發(fā)揮至關(guān)重要的作用。陳嘉貝［64］利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)對(duì)NaCl脅迫下兩個(gè)甜瓜(CucumismeloL.)品種‘玉露’和‘冰雪脆’的研究獲得共同響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄因子有27個(gè)，其中有9個(gè)為上調(diào)表達(dá),18個(gè)表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)。研究人員發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下，不同品種甜瓜的轉(zhuǎn)錄因子在其轉(zhuǎn)錄水平會(huì)表現(xiàn)出一定的品種特異性，即鹽脅迫可以誘導(dǎo)或抑制眾多轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，這為更好地理解甜瓜應(yīng)答鹽脅迫分子機(jī)制，以此增加對(duì)作物耐鹽機(jī)理的認(rèn)識(shí)，并為作物耐鹽功能研提供有效基因資源。近年來(lái)，基于第二代測(cè)序技術(shù)的基因表達(dá)譜分析在植物抗逆性研究領(lǐng)域扮演越來(lái)越重要的角色。對(duì)植物應(yīng)答非生物脅迫的研究可顯著地促進(jìn)對(duì)植物抵御和適應(yīng)生物脅迫分子機(jī)制的了解，進(jìn)而為深入展開(kāi)植物逆境生長(zhǎng)機(jī)理的相關(guān)研究，及植物在逆境中的非生物脅迫的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)互作提供了研究基礎(chǔ)。4前景與展望我們都知道，對(duì)生物體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是最主要的調(diào)控方式，而轉(zhuǎn)錄組可以從基因組水平上對(duì)植物體細(xì)胞RNA的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深度研究。就目前來(lái)看，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)正逐步取代傳統(tǒng)測(cè)序方法(如基因芯片技術(shù))而成為研究基因的主要手段。通過(guò)高通量測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組研究，一些如SmallRNA調(diào)控元件和Cis-antisense調(diào)控因子可能會(huì)在植物體的生理和病理方面擔(dān)任重要的角色。而且通過(guò)高效的轉(zhuǎn)錄組分析，可以對(duì)基因進(jìn)行功能注釋?zhuān)Y選特異表達(dá)基因，并發(fā)現(xiàn)新基因，進(jìn)-步為功能基因組學(xué)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。另外，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)植物轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序和分析，旨在揭示植物轉(zhuǎn)錄組的整體表達(dá)特征，為深入開(kāi)展植物生長(zhǎng)發(fā)育及其相關(guān)基因功能調(diào)控和分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等研究提供豐富的數(shù)據(jù)資源，進(jìn)一步推進(jìn)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育分子機(jī)制的探討。雖然新一代測(cè)序技術(shù)給植物轉(zhuǎn)錄組研究提供了便利條件并且取得了備受矚目的成就，然而信息平臺(tái)尚未完善，即在測(cè)序過(guò)程中產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)會(huì)成為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的巨大挑戰(zhàn)。其一，如何解讀和分析測(cè)序產(chǎn)生的龐大數(shù)據(jù)量所帶來(lái)的信息，并從成百上千個(gè)差異表達(dá)基因中挖掘感興趣的關(guān)鍵基因，從而發(fā)掘隱藏在原始數(shù)據(jù)中的生物學(xué)意義，解釋各種生物學(xué)現(xiàn)象；其二，如何將龐大的測(cè)序結(jié)果組裝成一個(gè)完整的基因組；其三，如何對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行高效分類(lèi)并存檔等問(wèn)題將成為研究人員不得不面臨的難題。不過(guò)，隨著測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷進(jìn)步，各種新型計(jì)算方法的出現(xiàn)將為數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)以及交流提供有利條件。參考文獻(xiàn):VelculescuVE, ZhangL,ZhouW,etal.Characterizationoftheyeasttranscriptome.Cell,1997,88：243-251.LanderES,LintonLM,BirrenB,etal.Initialsequencingandanalysisofthehumangenome.Nature,2001,409(6822)：860-921.黃琛，武明花，李桂源鼻咽癌轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2007,34(11)：1129-113楊曉玲，施蘇華，唐恬.新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用前景[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010(10)：76-81.于喆.基因芯片技術(shù)及其數(shù)據(jù)處理方法[J].科技通報(bào)，2012,28(5):70-75.AdamsMD,KelleyJM,GocayneJD,etal.ComplementaryDNAsequencing：expressedsequencetagsandhumangenomeproject.Science, 1991,252(5013)：1651-1656.MengL,ZengJJ.ProgressinExpressedSequenceTags(EST)ProjectofPlantGenome[J].ProgressInBiochemistryandBiophysics,2001,4:494-497.Martin,JK,PardeeAB,etal.Identifyingexpressedgenes[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2000,97(8):3789-3791.于秀梅.條繡菌誘導(dǎo)的小麥抑制差減雜交文庫(kù)構(gòu)建(SSH)及其表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)研究[D].西安:西北農(nóng)林科技大學(xué)，2006.Picoult-NewbergL,IdekerTE,PohlMG,etal.MiningSNPsfromESTdatabases[J].GenomeRes,1999,9(2)：167-174.BabulaD,KaczmarekM,BarakatA,etal.ChromosomalmappingofBrassicaoleraceabasedonESTsfromArabidopsisthaliana：complexityofthecomparativemap[J].MolecularGeneticsandGenomics,2003,268(5):656-665.LiangP,BauerD,AverboukhL,etal.Analysisofalteredgeneexpressionbydifferentialdisplay[J].Methodsinenzymology,1995,254:304-321.VeleulescuVE,ZhangL,VogelsteinB,etal.Serialanalysisofgeneexpression[J].Science,1995,270(5235)：484-487.HollingsworthPM.ForesstLL,SpougeJL,etal.ADNAbarcodeforlandplants[J].ProcNatlAcadSciUSA.2009.106：12794-12797.VodkinLO,ShoemakerRC,KeimO,etal.Soybeanfunctionalgenomics[A].Plant&AnimalGenomes9thConference.Town&CountryHotel,SanDiego,California,January,2001.13-17.MitchellTK,DeanRA,DonofrioN,EbboleD,FarmanM,OrbachM,SoderlundC,WangGL,WingR,XuJR.Wholegenomeanalysisofpathogen-hostrecognitionandsubsequentresponsesinthericeblastpatho-system.Plant&AnimalGenomes11thConference,Town&CountryHotel,SanDiego,Califonia,January11-15,2003BrennerS,JohnsonM,BridghamJ.Geneexpressionanalysisbymassivelyparallelsignaturesequencing(MPSS)onmicrobeadarrays[J].Naturebiotechnology,2000,18:630-63.ChaseMW,CowanRS,HollingsworthPM,etal.Aproposalforastandardisedprotocoltobarcodeallplants[J].Taxon,2007,56:295-299.LiDZ,GaoLM.LiHT,etal.Comparativeanalysisofalargedatasetindicatesthatinternaltranscribedspacer(ITS)shouldbeincorporatedintothecorebarcodesforseedplants[J]ProcNatlAcadSciUSA,2011,108：19641-19646.BrennerS,JohnsonM,BridghamJ,etal.Geneexpressionanalysisbymassivelyparallelsignaturesequencing(MPSS)onmicrobeadarrays.NatBiotechnol,2000,18：630-634.郭新紅，姜孝成，潘曉玲，等.基因芯片技術(shù)與基因表達(dá)譜分析[J].生物學(xué)雜志.2001，18(5)：1-2，13.AudicS，ClaverieJM.Thesignificanceofdigitalgeneexpressionprofiles[J].GenomeRes，1997，7：986-995.林彥.基于新一代測(cè)序技術(shù)的數(shù)字基因表達(dá)譜生物信息學(xué)分析平臺(tái)的建立及應(yīng)[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.QiXH，XuXW，LinXJ.Identificationofdifferentiallyexpressedgenesincucumber(CucumissativusL.)rootunderwaterloggingstressbydigitalgeneexpressionprofile[J].Genomics，2012，99(3)：160-168.秦楠，栗東芳，楊瑞籍.高通量測(cè)序技術(shù)及其在微生物研究中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)報(bào)，2011，51(4):455-457.陳士林，何柳，劉明珠，等.本草基因組方法學(xué)研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2010，12(3)：316-324.JiH，ShendureJ.Next-genrationDNAsequncing[J].NatBiotechnol，2008.26：1135-1145.AnsorgeWJ.Next-generationDNAsequencingtechniques[J].NatBiotechnol2009，25：195-203.NagalakshmiU，WangZ，WaernK，etal.ThetranscriptionallandscapeoftheyeastgenomedefinedbyRNAsequencing[J].Science，2008,320(5881)：1344-1349WangZ，GersteinM，SnyderM，RNA—Seq:arevolutionarytoolfortranscriptomics.NatRevGenet，2009，10(1):57—63.developmentandripeningusingRNA-Seq[J].BMCGenomics,2012，13:19.WilhelmBT，MargueratS，WattS，etal.Dynamicrepertoireofaeukaryotictranscriptomesurveyedatsingle-nucleotideresolution[J].Nature，2008，453(7199)：1239-1243.Gonzalez-BallesterD，CaseroD，CokusS.RNA-Seqanalysisofsulfur-deprivedChlamydomonascellrevealsasqectsofacclimationcriticalforcellsurvival[J].PlantCell，2010，22(6)：2058-2084.ZenoniS，F(xiàn)errariniA，GiacomelliE.CharacterizationoftranscriptionalcomplexityduringberrydevelopmentinVitsviniferausingRNA-Seq[J].PlantPhysiol，2010，152(4):178-1795.YangD，LiuQ，YangM.RNA-SeqlivertranscriptomeanalysisrevealsanactivatedMHC-IpathwayandaninhibitedMHC-IIpathwayattheearlystageofvaccineimmunizationinzebrafish[J].BMCGenomics，2012，13：319.王曦，汪小我，王立坤，等.新一代高通量RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的分析與處理[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2010，37(8)：834-846.LiangC，LiuX，YiuS，etal.DenovoassemblyandcharacterizationofCamelinasativatranscriptomebypaired-endsequencing[J].BMCGenomics，2013，14：146.WangH，JiangJ，ChenS，etal.Next-generationsequencingoftheChrysanthemumnankingense(Asteraceae)transcriptomepermitslarge-scaleunigeneassemblyandSSRmarkerdiscovery[J].PLoSOne,2013,8(4)：e62293.ChenX,ZhuW,AzamS,etal.Deepsequencinganalysisofthetranscriptomesofpeanutaerialandsubterraneanyoungpodsidentifiescandidategenesrelatedtoearlyembryoabortion[J].PlantBiotechnologyJournal,2013,11(1)：115-127.FengC,ChenM,XuCJ,etal.TranscriptomicanalysisofChinesebayberry(Myricarubra)fruitdevelopmentandripeningusingRNA-Seq[J].BMCGenomics,2012,Jan13；13：19.朱曉鋒，何衛(wèi)龍，蔡衛(wèi)佳.馬尾松轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析[J].分子植物育種，2013,11(3)：385-392.KakumanuA,AmbavaramMMR,KlumasC,etal.EffectsofdroughtongeneexpressioninmaizereproductiveandleafmeristemtissuerevealedbyRNA—Seq[J].Plantphysiology,2012,160(2)：846—867.LiPH,PonnalaL,GandotraN,etal.Thedevelopmentaldynamicsofthemaizeleaftranscriptome.Naturegenetics,2010,42(12)：1060-1067.翟榮榮.超級(jí)稻協(xié)優(yōu)9308根系雜種優(yōu)勢(shì)的轉(zhuǎn)錄組分析[D].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.ZhangG,GuoG,HuX,etal.DeepRNAsequencingatsinglebase-pairresolutionrevealshighcomplexityofthericetranscriptome[J].GenomeRes,2010,20(5)：646-654.張樂(lè)，金龍國(guó)，羅玲.大豆基因組和轉(zhuǎn)錄組的核基因密碼子使用偏好性分析[J].作物學(xué)報(bào)，2011,06：965—974.魏利斌,苗紅梅，張海洋.芝麻發(fā)育轉(zhuǎn)錄組分析[J].中國(guó)