原理與分析方法

內(nèi)容概要

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法絕對(duì)定量分析方法簡(jiǎn)介相對(duì)定量分析方法簡(jiǎn)介第1頁/共47頁第一頁，共48頁。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的概念實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)第2頁/共47頁第二頁，共48頁。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)涉及的概念

擴(kuò)增曲線熒光閾值

Ct值第3頁/共47頁第三頁，共48頁。擴(kuò)增曲線圖：橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件擴(kuò)增曲線第4頁/共47頁第四頁，共48頁。熒光信號(hào)的域值（threshold）：

前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99

真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過域值熒光域值第5頁/共47頁第五頁，共48頁。Ct值的定義：

PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t)valueCt值第6頁/共47頁第六頁，共48頁。橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性Ct值的重現(xiàn)性第7頁/共47頁第七頁，共48頁。Ct值定量數(shù)學(xué)原理理想的PCR反應(yīng)Xn＝X02n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0

：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)第8頁/共47頁第八頁，共48頁。Ct值定量數(shù)學(xué)原理非理想的PCR反應(yīng)Xn＝X0

（1＋En）n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0

：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)En：擴(kuò)增效率第9頁/共47頁第九頁，共48頁。Ct值定量數(shù)學(xué)原理在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到熒光閾值時(shí)XCt＝X0

（1＋En）Ct＝M（1）*XCt

：熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個(gè)常數(shù)，定為M方程式（1）兩邊同取對(duì)數(shù)得：LogM＝LogX0

*

（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：LogX0

＝LogM－CtLog（1＋En）第10頁/共47頁第十頁，共48頁。CyclenumberFlourescencCk104Ck102SampleCyclenumberLogofDNAconcentration

模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系Ct值定量數(shù)學(xué)原理LogX0

＝LogM－CtLog（1＋En）第11頁/共47頁第十一頁，共48頁。

mRNA表達(dá)的研究：如細(xì)胞因子、腫瘤耐藥基因表達(dá)分析

DNA拷貝數(shù)的定量：如易位基因的檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）分析基因型分析：雜合或純合子臨床檢測(cè)：病毒感染的定量監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用第12頁/共47頁第十二頁，共48頁。內(nèi)容概要

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法絕對(duì)定量分析方法簡(jiǎn)介相對(duì)定量分析方法簡(jiǎn)介第13頁/共47頁第十三頁，共48頁。非特異性熒光標(biāo)記：

1.SYBRGreen特異性熒光標(biāo)記：

2.TaqMan3.MolecularBeacon常用熒光標(biāo)記方法第14頁/共47頁第十四頁，共48頁。TaqMan---水解型雜交探針

5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)

探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針TaqMan方法第15頁/共47頁第十五頁，共48頁。TaqMan探針工作原理第16頁/共47頁第十六頁，共48頁。

標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對(duì)序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑分子信標(biāo)(MolecularBeacon)第17頁/共47頁第十七頁，共48頁。第18頁/共47頁第十八頁，共48頁。SYBRGreen法反應(yīng)示意圖SYBRGreenSYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光；變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光第19頁/共47頁第十九頁，共48頁。SYBRGreen法SYBRGreen結(jié)合到DNA小溝部位示意圖第20頁/共47頁第二十頁，共48頁。

幾種方法的應(yīng)用比較方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍SYBRGreenI方法適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶適合科研中對(duì)各種目的基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動(dòng)植物的研究TaqMan方法特異性高重復(fù)性好價(jià)格高只適合特定目標(biāo)病原體檢測(cè)，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷MolecularBeacon法(分子信標(biāo))高特異性熒光背景低只適合特定目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格高特定基因分析SNP分析第21頁/共47頁第二十一頁，共48頁。

起始模板的測(cè)定基因型的分析

融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對(duì)常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對(duì)primer的評(píng)價(jià)；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物SYBRGreen法的應(yīng)用第22頁/共47頁第二十二頁，共48頁。Sample25定量的方法

Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系

根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量第23頁/共47頁第二十三頁，共48頁。將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)融解曲線—分析產(chǎn)物的特異性第24頁/共47頁第二十四頁，共48頁。融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確非特異性產(chǎn)物融解曲線分析第25頁/共47頁第二十五頁，共48頁。SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)樣品制備模板準(zhǔn)備引物設(shè)計(jì)反應(yīng)條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數(shù)據(jù)分析儀器介紹RT上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇分析方法第26頁/共47頁第二十六頁，共48頁。樣品制備模板準(zhǔn)備引物設(shè)計(jì)反應(yīng)條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數(shù)據(jù)分析儀器介紹RT上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇分析方法SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)第27頁/共47頁第二十七頁，共48頁。樣品制備環(huán)境要求模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)濃度確定SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)無RNase環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具高純度，濃度均一的RNA分光光度計(jì)檢測(cè)電泳檢測(cè)第28頁/共47頁第二十八頁，共48頁。RT反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析上機(jī)AMVM-MLVQuantSuper下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積選擇應(yīng)用引物高效、全長的cDNASYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)第29頁/共47頁第二十九頁，共48頁。模板準(zhǔn)備引物設(shè)計(jì)濃度確定環(huán)境要求誤差控制RT樣品制備數(shù)據(jù)分析上機(jī)核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定濃度區(qū)間評(píng)價(jià)引物使用mix降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復(fù)（≥3次）設(shè)置空白和陰性對(duì)照均一的反應(yīng)液和模板混合物GC％：50－60％Tm：50－65℃單個(gè)堿基重復(fù)＜4個(gè)無二級(jí)結(jié)構(gòu)擴(kuò)增長度：100－200bp第30頁/共47頁第三十頁，共48頁。反應(yīng)體系優(yōu)化上機(jī)反應(yīng)條件優(yōu)化RT樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析反應(yīng)體積＞5ul，推薦20－50ulMg2＋調(diào)節(jié)，酶活調(diào)節(jié)引物濃度優(yōu)化，模板量?jī)?yōu)化退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時(shí)間：產(chǎn)物長度決定擴(kuò)增效率：90％－110％重復(fù)性：std＜0.2標(biāo)準(zhǔn)曲線：R＞0.99或R2

＞0.98SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)樣本陽性對(duì)照陰性對(duì)照第31頁/共47頁第三十一頁，共48頁。技能要求誤差控制儀器介紹上機(jī)試劑選擇RT樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析自配realmastermixRCHO-LightcyclerseriesROTOGEN-RGseriesBIO-RADOpticonseriesABI-7seriesBioer－Linegeneseries分裝控制內(nèi)參控制機(jī)器校正控制平滑曲線，重復(fù)性好，靈敏度高SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)第32頁/共47頁第三十二頁，共48頁。數(shù)據(jù)分析儀器介紹分析方法上機(jī)RT樣品制備模板準(zhǔn)備相對(duì)定量：2－△△Ct法絕對(duì)定量：標(biāo)準(zhǔn)曲線法可靠，準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)第33頁/共47頁第三十三頁，共48頁。內(nèi)容概要

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法絕對(duì)定量分析方法簡(jiǎn)介相對(duì)定量分析方法簡(jiǎn)介第34頁/共47頁第三十四頁，共48頁。絕對(duì)定量簡(jiǎn)介標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備第35頁/共47頁第三十五頁，共48頁。絕對(duì)定量簡(jiǎn)介拷貝數(shù)的計(jì)算待測(cè)樣本濃度（ng/ul）＝OD260×40×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測(cè)樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測(cè)樣本濃度/樣本分子量×6×1014倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v第36頁/共47頁第三十六頁，共48頁。擴(kuò)增效率（E）：擴(kuò)增效率與標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率相關(guān)：E=10－1/斜率，理論的擴(kuò)增效率理論值應(yīng)該為2，即每一個(gè)循環(huán)的PCR產(chǎn)物都翻倍，那么2＝10－1/斜率，優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率應(yīng)該為－3.32E用每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增模板百分比表示即：E％＝（E－1）×100％例如E＝1.95，那么E％＝（1.95－1）×100％，即每次循環(huán)有95％模板被擴(kuò)增擴(kuò)增效率概念絕對(duì)定量簡(jiǎn)介第37頁/共47頁第三十七頁，共48頁。絕對(duì)定量舉例：HBV病毒檢測(cè)Sample:HBV陽性標(biāo)準(zhǔn)品，分別含有5×103、5×104、5×105、5×106copies/mlcopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD5×10328.1828.6428.410.165×10425.2525.1425.190.045×10522.1122.4622.280.125×10618.6318.9218.770.10BLANKNoneNone實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：絕對(duì)定量簡(jiǎn)介第38頁/共47頁第三十八頁，共48頁。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作舉例擴(kuò)增效率（E）計(jì)算

E=10-1/斜率

=10-1/-3.17

=2.03E%=(2.03-1)×100%=103%標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.17x+37.52R2=0.9988第39頁/共47頁第三十九頁，共48頁。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作舉例如未知樣本Ct為20.5標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線將Ct值帶入線性方程：20.5=-3.1726X+37.52X=20.5-37.517-3.1726=5.36QuantityUnknown=105.36

=229087copiesy=-3.17x+37.52R2=0.9988第40頁/共47頁第四十頁，共48頁。內(nèi)容概要

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法絕對(duì)定量分析方法簡(jiǎn)介相對(duì)定量分析方法簡(jiǎn)介第41頁/共47頁第四十一頁，共48頁。分析方法：2－

△Ct

2－

△△CtPfaffi法相對(duì)定量簡(jiǎn)介應(yīng)用舉例：測(cè)定Jun基因在某因子作用前后的表達(dá)變化第42頁/共47頁第四十二頁，共48頁。2－△Ct法應(yīng)用舉例：測(cè)定Jun基因在某因子作用前后的表達(dá)變化比率（處理后/處理前）＝2－

Ct（處理后）－Ct（處理前）＝2－

△Ct＝2－

（16－18）＝42－

△Ct法：假設(shè)擴(kuò)增效率（E=10－1/斜率）為2（即每個(gè)循環(huán)模板量翻倍）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：Sample處理前處理后Jun(MeanCt)1816所以Jun基因在處理后表達(dá)水平比處理前高4倍第43頁/共47頁第四十三頁，共48頁。2－△△Ct法應(yīng)用舉例：測(cè)定Jun基因在某因子作用前后的表達(dá)變化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：Sample處理前處理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952-

△△Ct法：假設(shè)目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近100％，且相對(duì)偏差不超過5％△Ct（處理前）＝18－17＝1△Ct（處理后）＝16－17.4=－1.4△△Ct=△Ct（處理后）－△Ct（處理前）＝－1.4－1＝－2.4比率（處理后/處理前）=2－△△Ct＝2－（－2.4）＝5.3所以Jun基因在處理后表達(dá)水平比處理前高5.3倍修正方法：如果我們知道目標(biāo)基因和參照基因有相同的或增效率，但擴(kuò)增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正為：E－△△Ct，例如擴(kuò)增效率為1.95，那么計(jì)算公式可修正為1.95－△△Ct第44頁/共47頁第四十四頁，共48頁。Pfaffi法應(yīng)用舉例：測(cè)定Jun基因在某因子作用前后的表達(dá)變化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：Sample處理前處理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E（J）18161717.41.951.95Pfaffi法：假設(shè)目標(biāo)基因和參照基因擴(kuò)增效率不同，但目標(biāo)基因間的擴(kuò)增效率相同E（G）1.91.9比率處理后/處理前＝E（參照基因）△Ct（處理前