原理與分析方法

內容概要

實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法絕對定量分析方法簡介相對定量分析方法簡介第1頁/共47頁第一頁，共48頁。實時定量PCR技術的概念實時定量PCR技術：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析與常規(guī)PCR技術比較：對PCR擴增反應的終點產物進行定量和定性分析無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測第2頁/共47頁第二頁，共48頁。實時熒光定量PCR技術涉及的概念

擴增曲線熒光閾值

Ct值第3頁/共47頁第三頁，共48頁。擴增曲線圖：橫坐標：擴增循環(huán)數（Cycle）；縱坐標：熒光強度每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集熒光基團熒光檢測元件擴增曲線第4頁/共47頁第四頁，共48頁。熒光信號的域值（threshold）：

前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值熒光域值的缺省設置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍手動設置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數期的最初階段，并且保證回歸系數大于0.99

真正的信號:熒光信號超過域值熒光域值第5頁/共47頁第五頁，共48頁。Ct值的定義：

PCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環(huán)次數C(t)valueCt值第6頁/共47頁第六頁，共48頁。橫軸：PCR反映循環(huán)數縱軸：熒光信號量Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產物量不恒定；Ct值極具重現性Ct值的重現性第7頁/共47頁第七頁，共48頁。Ct值定量數學原理理想的PCR反應Xn＝X02n*Xn：第n次循環(huán)后擴增產物數量X0

：起始模板數量n：擴增循環(huán)數第8頁/共47頁第八頁，共48頁。Ct值定量數學原理非理想的PCR反應Xn＝X0

（1＋En）n*Xn：第n次循環(huán)后擴增產物數量X0

：起始模板數量n：擴增循環(huán)數En：擴增效率第9頁/共47頁第九頁，共48頁。Ct值定量數學原理在擴增產物達到熒光閾值時XCt＝X0

（1＋En）Ct＝M（1）*XCt

：熒光擴增信號達到閾值時擴增產物的量，在閾值設定以后，它是一個常數，定為M方程式（1）兩邊同取對數得：LogM＝LogX0

*

（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：LogX0

＝LogM－CtLog（1＋En）第10頁/共47頁第十頁，共48頁。CyclenumberFlourescencCk104Ck102SampleCyclenumberLogofDNAconcentration

模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數越少

Log濃度與循環(huán)數呈線性關系Ct值定量數學原理LogX0

＝LogM－CtLog（1＋En）第11頁/共47頁第十一頁，共48頁。

mRNA表達的研究：如細胞因子、腫瘤耐藥基因表達分析

DNA拷貝數的定量：如易位基因的檢測單核苷酸多態(tài)性（SNPs）分析基因型分析：雜合或純合子臨床檢測：病毒感染的定量監(jiān)測實時熒光定量PCR技術的應用第12頁/共47頁第十二頁，共48頁。內容概要

實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法絕對定量分析方法簡介相對定量分析方法簡介第13頁/共47頁第十三頁，共48頁。非特異性熒光標記：

1.SYBRGreen特異性熒光標記：

2.TaqMan3.MolecularBeacon常用熒光標記方法第14頁/共47頁第十四頁，共48頁。TaqMan---水解型雜交探針

5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)

探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針TaqMan方法第15頁/共47頁第十五頁，共48頁。TaqMan探針工作原理第16頁/共47頁第十六頁，共48頁。

標記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標序列互補莖由互補配對序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑分子信標(MolecularBeacon)第17頁/共47頁第十七頁，共48頁。第18頁/共47頁第十八頁，共48頁。SYBRGreen法反應示意圖SYBRGreenSYBRGreen只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光；變性時，DNA雙鏈分開，無熒光第19頁/共47頁第十九頁，共48頁。SYBRGreen法SYBRGreen結合到DNA小溝部位示意圖第20頁/共47頁第二十頁，共48頁。

幾種方法的應用比較方法優(yōu)點缺點適用范圍SYBRGreenI方法適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現非特異性帶適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表達量的研究，轉基因重組動植物的研究TaqMan方法特異性高重復性好價格高只適合特定目標病原體檢測，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷MolecularBeacon法(分子信標)高特異性熒光背景低只適合特定目標設計困難價格高特定基因分析SNP分析第21頁/共47頁第二十一頁，共48頁。

起始模板的測定基因型的分析

融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應的條件，對常規(guī)PCR有指導意義，如對primer的評價；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產物、多種產物SYBRGreen法的應用第22頁/共47頁第二十二頁，共48頁。Sample25定量的方法

Log（起始濃度）與循環(huán)數呈線性關系，通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線,即得到該擴增反應存在的線性關系

根據樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量第23頁/共47頁第二十三頁，共48頁。將溫度與熒光強度的變化求導。(-dI/dT)融解曲線—分析產物的特異性第24頁/共47頁第二十四頁，共48頁。融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準確融解曲線分析，出現雜峰其他產物出現非特異性熒光，因此定量不準確非特異性產物融解曲線分析第25頁/共47頁第二十五頁，共48頁。SYBR法實驗流程及注意事項樣品制備模板準備引物設計反應條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數據分析儀器介紹RT上機反應體系優(yōu)化試劑選擇分析方法第26頁/共47頁第二十六頁，共48頁。樣品制備模板準備引物設計反應條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數據分析儀器介紹RT上機反應體系優(yōu)化試劑選擇分析方法SYBR法實驗流程及注意事項第27頁/共47頁第二十七頁，共48頁。樣品制備環(huán)境要求模板準備數據分析RT上機濃度確定SYBR法實驗流程及注意事項無RNase環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具高純度，濃度均一的RNA分光光度計檢測電泳檢測第28頁/共47頁第二十八頁，共48頁。RT反應體系優(yōu)化試劑選擇樣品制備模板準備數據分析上機AMVM-MLVQuantSuper下游反應數確定反轉錄體積選擇應用引物高效、全長的cDNASYBR法實驗流程及注意事項第29頁/共47頁第二十九頁，共48頁。模板準備引物設計濃度確定環(huán)境要求誤差控制RT樣品制備數據分析上機核酸制備區(qū)反應液制備區(qū)制作標準曲線設定濃度區(qū)間評價引物使用mix降低系統(tǒng)誤差設置重復（≥3次）設置空白和陰性對照均一的反應液和模板混合物GC％：50－60％Tm：50－65℃單個堿基重復＜4個無二級結構擴增長度：100－200bp第30頁/共47頁第三十頁，共48頁。反應體系優(yōu)化上機反應條件優(yōu)化RT樣品制備模板準備數據分析反應體積＞5ul，推薦20－50ulMg2＋調節(jié)，酶活調節(jié)引物濃度優(yōu)化，模板量優(yōu)化退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時間：產物長度決定擴增效率：90％－110％重復性：std＜0.2標準曲線：R＞0.99或R2

＞0.98SYBR法實驗流程及注意事項標準品待測樣本陽性對照陰性對照第31頁/共47頁第三十一頁，共48頁。技能要求誤差控制儀器介紹上機試劑選擇RT樣品制備模板準備數據分析自配realmastermixRCHO-LightcyclerseriesROTOGEN-RGseriesBIO-RADOpticonseriesABI-7seriesBioer－Linegeneseries分裝控制內參控制機器校正控制平滑曲線，重復性好，靈敏度高SYBR法實驗流程及注意事項第32頁/共47頁第三十二頁，共48頁。數據分析儀器介紹分析方法上機RT樣品制備模板準備相對定量：2－△△Ct法絕對定量：標準曲線法可靠，準確的數據SYBR法實驗流程及注意事項第33頁/共47頁第三十三頁，共48頁。內容概要

實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法絕對定量分析方法簡介相對定量分析方法簡介第34頁/共47頁第三十四頁，共48頁。絕對定量簡介標準樣品的制備第35頁/共47頁第三十五頁，共48頁。絕對定量簡介拷貝數的計算待測樣本濃度（ng/ul）＝OD260×40×稀釋倍數樣本分子量=堿基數×324待測樣本拷貝數（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量×6×1014倍比梯度稀釋方法：1v原液(標準品i)+9v稀釋緩沖液，得標準品ii1v標準品ii+9v稀釋緩沖液，得標準品iii1v標準品iii+9v稀釋緩沖液，得標準品iv1v標準品iv+9v稀釋緩沖液，得標準品v第36頁/共47頁第三十六頁，共48頁。擴增效率（E）：擴增效率與標準曲線的斜率相關：E=10－1/斜率，理論的擴增效率理論值應該為2，即每一個循環(huán)的PCR產物都翻倍，那么2＝10－1/斜率，優(yōu)化的標準曲線斜率應該為－3.32E用每個循環(huán)擴增模板百分比表示即：E％＝（E－1）×100％例如E＝1.95，那么E％＝（1.95－1）×100％，即每次循環(huán)有95％模板被擴增擴增效率概念絕對定量簡介第37頁/共47頁第三十七頁，共48頁。絕對定量舉例：HBV病毒檢測Sample:HBV陽性標準品，分別含有5×103、5×104、5×105、5×106copies/mlcopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD5×10328.1828.6428.410.165×10425.2525.1425.190.045×10522.1122.4622.280.125×10618.6318.9218.770.10BLANKNoneNone實驗數據：絕對定量簡介第38頁/共47頁第三十八頁，共48頁。標準曲線制作舉例擴增效率（E）計算

E=10-1/斜率

=10-1/-3.17

=2.03E%=(2.03-1)×100%=103%標準曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標準曲線y=-3.17x+37.52R2=0.9988第39頁/共47頁第三十九頁，共48頁。標準曲線制作舉例如未知樣本Ct為20.5標準曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標準曲線將Ct值帶入線性方程：20.5=-3.1726X+37.52X=20.5-37.517-3.1726=5.36QuantityUnknown=105.36

=229087copiesy=-3.17x+37.52R2=0.9988第40頁/共47頁第四十頁，共48頁。內容概要

實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法絕對定量分析方法簡介相對定量分析方法簡介第41頁/共47頁第四十一頁，共48頁。分析方法：2－

△Ct

2－

△△CtPfaffi法相對定量簡介應用舉例：測定Jun基因在某因子作用前后的表達變化第42頁/共47頁第四十二頁，共48頁。2－△Ct法應用舉例：測定Jun基因在某因子作用前后的表達變化比率（處理后/處理前）＝2－

Ct（處理后）－Ct（處理前）＝2－

△Ct＝2－

（16－18）＝42－

△Ct法：假設擴增效率（E=10－1/斜率）為2（即每個循環(huán)模板量翻倍）實驗數據：Sample處理前處理后Jun(MeanCt)1816所以Jun基因在處理后表達水平比處理前高4倍第43頁/共47頁第四十三頁，共48頁。2－△△Ct法應用舉例：測定Jun基因在某因子作用前后的表達變化實驗數據：Sample處理前處理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952-

△△Ct法：假設目的基因和參照基因擴增效率都接近100％，且相對偏差不超過5％△Ct（處理前）＝18－17＝1△Ct（處理后）＝16－17.4=－1.4△△Ct=△Ct（處理后）－△Ct（處理前）＝－1.4－1＝－2.4比率（處理后/處理前）=2－△△Ct＝2－（－2.4）＝5.3所以Jun基因在處理后表達水平比處理前高5.3倍修正方法：如果我們知道目標基因和參照基因有相同的或增效率，但擴增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正為：E－△△Ct，例如擴增效率為1.95，那么計算公式可修正為1.95－△△Ct第44頁/共47頁第四十四頁，共48頁。Pfaffi法應用舉例：測定Jun基因在某因子作用前后的表達變化實驗數據：Sample處理前處理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E（J）18161717.41.951.95Pfaffi法：假設目標基因和參照基因擴增效率不同，但目標基因間的擴增效率相同E（G）1.91.9比率處理后/處理前＝E（參照基因）△Ct（處理前