真核細(xì)胞周期調(diào)控分子機(jī)制唐旭東級(jí)

2001年10月8日美國(guó)人Leland

Hartwell、英國(guó)人PaulNurse、Timothy

Hunt因?qū)?xì)胞周期調(diào)控機(jī)理的研究而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

第2頁/共65頁第1頁/共65頁第一頁，共66頁。第一節(jié)

細(xì)胞周期及調(diào)控的概述第3頁/共65頁第2頁/共65頁第二頁，共66頁。細(xì)胞周期間期(interphase)分裂期

(M)G1期(合成前期)S期(DNA合成期)G2期(合成后期)前期(prophase)中期

(metaphase)后期

(anaphase)末期

(telophase)一、細(xì)胞周期(cellcycle)有絲分裂(mitosis)胞質(zhì)分裂(cytokinesis)第4頁/共65頁第3頁/共65頁第三頁，共66頁。第5頁/共65頁第4頁/共65頁第四頁，共66頁。細(xì)胞周期的不同時(shí)相(phase)G0裂殖酵母第6頁/共65頁第5頁/共65頁第五頁，共66頁。二、細(xì)胞周期調(diào)控的主要分子機(jī)制細(xì)胞周期引擎——異二聚體蛋白激酶復(fù)合體

包括二個(gè)亞單位：調(diào)節(jié)亞單位：細(xì)胞周期蛋白（cyclin）

cyclin濃度隨細(xì)胞周期不斷變化催化亞單位：細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependentkinase，CDK)-CDK單獨(dú)存在時(shí)無活性，與cyclin結(jié)合才具有激酶的活性;-cyclin不僅起激活CDK的作用，還決定了CDK何時(shí)、何處、將何種底物磷酸化。第7頁/共65頁第6頁/共65頁第六頁，共66頁。三種控制細(xì)胞周期進(jìn)程的細(xì)胞周期蛋白-CDK復(fù)合體：

G1、S期和有絲分裂-CDK復(fù)合體（G1-CDK復(fù)合體的合成和活性的調(diào)節(jié)是細(xì)胞周期的主要調(diào)控機(jī)制）前復(fù)制復(fù)合體（pre-replicationcomplex，pre-RC）：

其磷酸化既可啟動(dòng)DNA的復(fù)制，又可防止新的前復(fù)制復(fù)合體組裝翻譯后調(diào)節(jié)機(jī)制：蛋白磷酸化、泛素依賴的蛋白降解第8頁/共65頁第7頁/共65頁第七頁，共66頁。三、研究細(xì)胞周期調(diào)控的實(shí)驗(yàn)體系（一）細(xì)胞的DNA含量提示其所處的細(xì)胞周期時(shí)相

用與DNA結(jié)合的熒光染料處理細(xì)胞，再用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定每一細(xì)胞的DNA含量。熒光激活的細(xì)胞分選儀（FACS)（二）細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)（三）互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)第9頁/共65頁第8頁/共65頁第八頁，共66頁。G0+G1SG2+MG0+G1SG2+MControlDrug-treated細(xì)胞周期阻滯于S期第10頁/共65頁第9頁/共65頁第九頁，共66頁。ControlG0+G1G0+G1G0+G1G0+G1G2+MG2+MG2+MG2+MSSSS細(xì)胞周期阻滯于G2期第11頁/共65頁第10頁/共65頁第十頁，共66頁。參與細(xì)胞周期調(diào)控的分子第二節(jié)第12頁/共65頁第11頁/共65頁第十一頁，共66頁。一、細(xì)胞周期蛋白（cyclin）種類：

目前分離出30余種脊椎動(dòng)物：A1-2、B1-3、CD1-3、E1-2、F、G、H等人類：A、B、C、D、E。分類：不同時(shí)相發(fā)揮作用

G1周期蛋白：在G1期發(fā)揮作用（CDE）

（S和）M期周期蛋白：AB

在G2/M調(diào)控點(diǎn)發(fā)揮作用第13頁/共65頁第12頁/共65頁第十二頁，共66頁。一、細(xì)胞周期蛋白（cyclin）共同結(jié)構(gòu)：均含有一段約100~150個(gè)氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白盒（cyclinbox)，是與CDK結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)。功能：不同的cyclin識(shí)別不同的CDK，組成不同的cyclin-CDK復(fù)合物，表現(xiàn)出不同的CDK激酶的活性。第14頁/共65頁第13頁/共65頁第十三頁，共66頁。G1周期蛋白表達(dá)順序：先cyclinCD，再cyclinEcyclinD和E，為細(xì)胞通過限制點(diǎn)所必需cyclinD亞類：D1D2D3cyclinDCDK：4、6cyclinD功能：使下游蛋白磷酸化如：CDK4/6-cyclinD使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，Rb）蛋白磷酸化釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F促進(jìn)CDK2、cyclinE表達(dá)進(jìn)一步磷酸化Rb陽性反饋回路*此時(shí)細(xì)胞周期不依賴CDK4/6-cyclinD復(fù)合體的活性第15頁/共65頁第14頁/共65頁第十四頁，共66頁。細(xì)胞周期的調(diào)控

CDK1/CycB*CyclinD和E在G1期表達(dá)，為細(xì)胞通過限制點(diǎn)所必需第16頁/共65頁第15頁/共65頁第十五頁，共66頁。S和M期周期蛋白合成順序：A早于B（1）

cyclinA：

與CDK1和CDK2形成復(fù)合物（2）cyclinB亞類：B1B2B3合成：

在胚胎細(xì)胞周期中連續(xù)合成，但在有絲分裂后期（晚期）迅速降解。

？？

CDK：1第17頁/共65頁第16頁/共65頁第十六頁，共66頁。二、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）種類：目前動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)9種，人類7種（1~7)共同結(jié)構(gòu)：相似的激酶結(jié)構(gòu)域，是一段保守序列，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。至少有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：T-loop、ATP結(jié)合位點(diǎn)激活：Cyclin與CDK結(jié)合為CDK發(fā)揮酶活性所必需但CDK僅與Cyclin結(jié)合并不能使CDK激活只有T-loop中的Thr161殘基磷酸化才能使CDK激活。第18頁/共65頁第17頁/共65頁第十七頁，共66頁。二、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）功能：在不同細(xì)胞時(shí)相，特定的CDK與特定的cyclin形成細(xì)胞周期特異的蛋白激酶復(fù)合體，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程。激活的CDK1可將靶蛋白磷酸化而產(chǎn)生相應(yīng)的生理效應(yīng)。第19頁/共65頁第18頁/共65頁第十八頁，共66頁。脊椎動(dòng)物細(xì)胞CDK-細(xì)胞周期蛋白復(fù)合體

CDK細(xì)胞周期蛋白功能CDK1cyclinB1,B2,B3

有絲分裂

cyclinAG2/MCDK2cyclinAS期

cyclinEG1/SCDK3？G1/S?CDK4/6cyclinD1,D2,D3G1期第20頁/共65頁第19頁/共65頁第十九頁，共66頁。三、泛素與APC泛素（ubiquitin)組成和分布：由76個(gè)氨基酸組成，高度保守，普遍存在于真核細(xì)胞，故名泛素；作用：共價(jià)結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識(shí)別和降解，這是細(xì)胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑。第21頁/共65頁第20頁/共65頁第二十頁，共66頁。把泛素加到周期蛋白或其他蛋白需要3個(gè)酶:泛素激活酶(E1):泛素-CO~S-Cys-E1(活化)泛素結(jié)合酶(E2):泛素-CO~S-Cys-E2(轉(zhuǎn)硫酯）泛素連接酶(E3):泛素-CO~NH-Lys-底物蛋白(標(biāo)記)

泛素與被選擇降解的蛋白質(zhì)形成共價(jià)連接，使后者標(biāo)記并被激活，稱為泛素化。蛋白酶體可迅速將泛素化的底物蛋白降解后期促進(jìn)復(fù)合體（anaphasepromotingcomplex，APC

）就是一種E3,可將泛素連到M期周期蛋白上作用機(jī)制：第22頁/共65頁第21頁/共65頁第二十一頁，共66頁。分裂期周期蛋白B的N端有一段序列與其降解有關(guān)，稱破壞作用盒(destructionbox)；APC使E2-泛素復(fù)合體找到破壞作用盒，并將泛素轉(zhuǎn)移到位于盒C端的Lys殘基；泛素化---多泛素化共價(jià)結(jié)合一串泛素的過程，稱為多泛素化(polyubiquitination)。周期蛋白B被蛋白酶體識(shí)別而降解周期蛋白B(cyclinB)如何降解？第23頁/共65頁第22頁/共65頁第二十二頁，共66頁。細(xì)胞周期蛋白的破壞作用盒與降解途徑第24頁/共65頁第23頁/共65頁第二十三頁，共66頁。其他蛋白的降解G1期周期蛋白也通過類似的途徑降解，但其N端沒有破環(huán)作用盒，C端有一段PEST序列與其降解有關(guān)。

PEST序列：指富含脯氨酸（P)、谷氨酸（E)、天冬氨酸、絲氨酸（S)和蘇氨酸（T)的殘基序列缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxiainduciblefactor–1α，HIF-1α)第25頁/共65頁第24頁/共65頁第二十四頁，共66頁。ExpressionandactivationofHIF-1αareregulatedbytheoxygenconcentration

*Undernormoxicconditions:

hydroxylationinteractionwithvonHippel-Lindau(pVHL)pVHLis

animportantcomponentoftheE3ubiquitinligasecomplex.ubiquitinizationanddegradation*Underhypoxicconditions:InhibitionofhydroxylationSuppressionofdegradationaccumulationHypoxiainduciblefactor–1

α

(HIF-1α)第26頁/共65頁第25頁/共65頁第二十五頁，共66頁。四、生長(zhǎng)因子(growthfactor)生長(zhǎng)因子是一大類與細(xì)胞增殖有關(guān)的信號(hào)物質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子多達(dá)幾十種；多數(shù)有促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能，故又稱有絲分裂原（mitogen），如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）等；少數(shù)具有抑制作用（或稱生長(zhǎng)抑制因子）如抑素(chalone)、腫瘤壞死因子（TNF）、c-mos原癌基因產(chǎn)物、p39mos(Mos)。第27頁/共65頁第26頁/共65頁第二十六頁，共66頁。生長(zhǎng)因子的作用機(jī)理

第28頁/共65頁第27頁/共65頁第二十七頁，共66頁。五、周期蛋白-激酶抑制因子

（CDK-kinase

inhibitor，CKI）

CKI對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用CKI分為兩大家族：

※INK4(Inhibitorofkinase4)家族

※CIP/KIP家族

CIP:CDKinhibitoryproteinKIP:Kinaseinhibitoryprotein第29頁/共65頁第28頁/共65頁第二十八頁，共66頁。一、INK4家族的CKI包括：P16(INK4a)、P15(INK4b)、P18(INK4c)、P19(INK4d)共同結(jié)構(gòu)：

4個(gè)錨（ankyrin）重復(fù)序列CDK：識(shí)別CDK4、6，不識(shí)別CDK2功能：通過與cyclinD競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CDK4而引起細(xì)胞周期在G1期停滯第30頁/共65頁第29頁/共65頁第二十九頁，共66頁。一、INK4家族的CKI（一）P16功能：結(jié)合CDK4和CDK6，抑制CDK-cyclinD復(fù)合體的催化活性使細(xì)胞周期在G1期停滯意義：P16的嚴(yán)格調(diào)節(jié)對(duì)維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)是必需的常在腫瘤和癌細(xì)胞中缺失或滅活（甲基化）第31頁/共65頁第30頁/共65頁第三十頁，共66頁。一、INK4家族的CKI（二）P15誘導(dǎo)劑：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）意義：甲基化使P15啟動(dòng)子沉默在血液惡性病變中起重要作用P15的異常甲基化對(duì)估計(jì)預(yù)后具有意義※P15和P16都具有抑制端粒酶活性和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用（具有腫瘤抑制作用）第32頁/共65頁第31頁/共65頁第三十一頁，共66頁。二、CIP/KIP

家族的CKI包括:：

P21(CIP1/WAF1/SDI)、P27(KIP1)、P57(kip2）等共同結(jié)構(gòu)：N端CDK抑制性功能域功能：抑制CDK2-細(xì)胞周期蛋白A和CDK2-細(xì)胞周期蛋白E的激酶活性。過多表達(dá)引起G1期細(xì)胞周期蛋白停滯。P21和P27是CDK4的激活因子。第33頁/共65頁第32頁/共65頁第三十二頁，共66頁。（一）P21結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：?jiǎn)?dòng)子上有P53結(jié)合位點(diǎn)功能：DNA損傷時(shí)G1期停滯的關(guān)鍵性決定因素在G2/M轉(zhuǎn)折中起作用參與細(xì)胞的終末分化和衰老與DNA聚合酶δ的輔助因子PCNA結(jié)合，直接抑制DNA的合成。表達(dá)調(diào)節(jié)：P53的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)P53-非依賴的調(diào)節(jié)：P202、STAT信號(hào)通路、癌基因產(chǎn)物的負(fù)性調(diào)節(jié)（c-Myc、Set、Her2）第34頁/共65頁第33頁/共65頁第三十三頁，共66頁。第35頁/共65頁第34頁/共65頁第三十四頁，共66頁。

（二）P27表達(dá)調(diào)節(jié)：上調(diào)信號(hào)：phosphataseandtensionhomolog(PTEN)Forkhead轉(zhuǎn)錄因子

(Afx、Fkhr、Fkhr-L1）下調(diào)信號(hào)：CpG島過度甲基化癌蛋白（c-Myc、Her2)（三）P57

在Beckwith-Wiedeman綜合征（BWS)中丟失受IGF-II的負(fù)調(diào)節(jié)第36頁/共65頁第35頁/共65頁第三十五頁，共66頁。三、新的CKI-14-3-3σ14-3-3家族的成員之一與細(xì)胞分裂周期(celldivisioncycle，CDC)有關(guān)的基因CDC2、CDK2和CDK4相互作用抑制CDK活性阻斷細(xì)胞周期進(jìn)展第37頁/共65頁第36頁/共65頁第三十六頁，共66頁。Cellcycle主要直接依賴于一系列異二聚體蛋白激酶復(fù)合體的調(diào)節(jié)；蛋白激酶復(fù)合體的活性依賴于各種cyclins的合成與降解；Cyclins的合成受各種生長(zhǎng)因子影響；Cyclins的降解與泛素降解途徑有關(guān)；蛋白激酶復(fù)合體的活性還受CKI抑制。小結(jié)第38頁/共65頁第37頁/共65頁第三十七頁，共66頁。第三節(jié)細(xì)胞周期的運(yùn)行第39頁/共65頁第38頁/共65頁第三十八頁，共66頁。細(xì)胞周期和其他的一些細(xì)胞生理過程就像多米諾骨牌

第40頁/共65頁第39頁/共65頁第三十九頁，共66頁。細(xì)胞在生長(zhǎng)因子的刺激下，G1期cyclinD表達(dá)；并與CDK4、CDK6結(jié)合而活化激酶；G1-CDK使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，磷酸化的Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F；促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A和CDK1\2的基因。在G1-S期，cyclinE與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S限制點(diǎn)而進(jìn)入S期。

一、細(xì)胞周期的啟動(dòng)（G0→G1）第41頁/共65頁第40頁/共65頁第四十頁，共66頁。生長(zhǎng)因子促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期第42頁/共65頁第41頁/共65頁第四十一頁，共66頁。CyclinD與CDK結(jié)合

使Rb釋放結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F

第43頁/共65頁第42頁/共65頁第四十二頁，共66頁。二、DNA復(fù)制（G1→S

）在G1-S期，cyclinE與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S限制點(diǎn)而進(jìn)入S期。DNA的復(fù)制是由復(fù)制起始點(diǎn)（originsofreplication）開始的;復(fù)制起始點(diǎn)也就是自主復(fù)制序列，散布在染色體上;在整個(gè)細(xì)胞周期中，復(fù)制起始點(diǎn)上結(jié)合有起始識(shí)別復(fù)合體（Originrecognitioncomplex,ORC）;第44頁/共65頁第43頁/共65頁第四十三頁，共66頁。CDC6是一個(gè)調(diào)節(jié)因子，在G1期CDC6含量瞬間提高;細(xì)胞分裂周期(celldivisioncycle，CDC)

基因CDC6結(jié)合在ORC上，在ATP供能下，促進(jìn)6個(gè)亞單位構(gòu)成的小染色體維持蛋白（mini-chromatinmaintenanceprotein,

MCM）復(fù)合體和其他一些蛋白結(jié)合到ORC上，形成前復(fù)制復(fù)合體（pre-RC）;-MCM實(shí)際上就是DNA解螺旋酶（helicase）

第45頁/共65頁第44頁/共65頁第四十四頁，共66頁。起始識(shí)別復(fù)合體起始復(fù)制點(diǎn)第46頁/共65頁第45頁/共65頁第四十五頁，共66頁。S-CDK觸發(fā)pre-RC的啟動(dòng)，同時(shí)阻止了DNA再次進(jìn)行復(fù)制;

因?yàn)镾-CDK將CDC6磷酸化，使其脫離ORC;磷酸化的CDC6隨后被SCF(skpi-cullin-F-boxprotein)參與的泛素化途徑降解；

(SCF復(fù)合體將泛素連接到G1/S期cyclin)S-CDK還可以將某些MCM磷酸化，使其被輸出細(xì)胞核;其它一些CDK也參與阻止pre-RC的再次形成，從而保證了DNA僅復(fù)制一次。第47頁/共65頁第46頁/共65頁第四十六頁，共66頁。每條染色體在一個(gè)細(xì)胞周期僅復(fù)制一次第48頁/共65頁第47頁/共65頁第四十七頁，共66頁。三、進(jìn)入M期(G2-M)在G2-M期，cyclinA、cyclinB與CDK1結(jié)合，形成M-CDK；M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的積累，在胚胎細(xì)胞周期中cyclin一直在合成，其濃度決定于降解的速度；但在大多數(shù)細(xì)胞的有絲分裂周期中，cyclin的積累是因?yàn)樵贕2-M期M-cyclin基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng);第49頁/共65頁第48頁/共65頁第四十八頁，共66頁。隨著M-cyclin的積累，結(jié)合周期蛋白的M-CDK（CDK1）增加，但是沒有活性;

---因?yàn)橐种埔蜃覹ee1激酶將CDK1的Thr14和Tyr15磷酸化#52---這種機(jī)制保證了CDK-cyclin能夠不斷積累，然后在需要的時(shí)候突然釋放。

#53.第50頁/共65頁第49頁/共65頁第四十九頁，共66頁。CDK1的激活——需要Thr14和Tyr15去磷酸化和Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDKactivatingkinase,CAK)的作用下完成的

第51頁/共65頁第50頁/共65頁第五十頁，共66頁。在M期，一方面Wee1的活性下降;另一方面CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障礙;CDC25可被兩種激酶激活，一是polo激酶，另一個(gè)是M-CDK本身;激活的M-CDK還可以抑制它的抑制因子Wee1的活性，形成一個(gè)正反饋循環(huán);只要有少量的CDK1被CDC25或polo激酶激活，立即就會(huì)有大量的CDK被活化。第52頁/共65頁第51頁/共65頁第五十一頁，共66頁。在中期當(dāng)成熟促進(jìn)因子

(maturationpromotingfactor,MPF)或稱為有絲分裂和減數(shù)分裂促進(jìn)因子（mitosisandmeiosispromotingfactor,MPF)活性達(dá)到最高時(shí)，激活A(yù)PC;APC將泛素連接在cyclinB上，導(dǎo)致cyclinB被蛋白酶體（proteasome）降解;完成一個(gè)細(xì)胞周期。第53頁/共65頁第52頁/共65頁第五十二頁，共66頁。CyclinB的降解途徑

第54頁/共65頁第53頁/共65頁第五十三頁，共66頁。第四節(jié)細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)與周期阻滯第55頁/共65頁第54頁/共65頁第五十四頁，共66頁。細(xì)胞要分裂，必須正確復(fù)制DNA和達(dá)到一定的體積，在獲得足夠物質(zhì)支持分裂以前，細(xì)胞不可能進(jìn)行分裂;細(xì)胞周期的運(yùn)行，是在一系列稱為細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)（checkpoint）的嚴(yán)格監(jiān)控下進(jìn)行的;檢驗(yàn)點(diǎn)的作用：當(dāng)DNA受到損傷時(shí),復(fù)制不完全或紡錘體形成不正常，周期將被阻斷。檢驗(yàn)點(diǎn)的組成：由感受異常事件的感受器、信號(hào)傳導(dǎo)通路和效應(yīng)器構(gòu)成。第56頁/共65頁第55頁/共65頁第五十五頁，共66頁。主要檢驗(yàn)點(diǎn)有：G0/G1檢驗(yàn)點(diǎn):控制從靜止?fàn)顟B(tài)的G0期進(jìn)入G1期G1/S檢驗(yàn)點(diǎn):

在哺乳動(dòng)物中稱限制點(diǎn)(restrictionpoint)或簡(jiǎn)稱R點(diǎn)，控制細(xì)胞由G1進(jìn)入DNA合成期。#17

細(xì)胞可能的3種命運(yùn)：繼續(xù)增殖、暫不增殖、不增殖而分化S期檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA復(fù)制是否完成？G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)：是決定細(xì)胞一分為二的控制點(diǎn)。相關(guān)的事件包括：DNA損傷？細(xì)胞體積足夠大？中-后期檢驗(yàn)點(diǎn)（紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)）：任何一個(gè)著絲點(diǎn)沒有正確連接到紡錘體上，都會(huì)引起細(xì)胞周期中斷。第57頁/共65頁第56頁/共65頁第五十六頁，共66頁。主要的檢驗(yàn)點(diǎn)

第58頁/共65頁第57頁/共65頁第五十七頁，共66頁。第