液相色譜分析

液相色譜分析1第一頁，共五十二頁，2022年，8月28日第四章高效液相色譜分析第一節(jié)概述第二節(jié)HPLC儀器第三節(jié)高效液相色譜法的類型及分離原理第四節(jié)色譜分離方法的選擇第五節(jié)高效毛細(xì)管電泳簡介第六節(jié)紙層析和薄層層析2第二頁，共五十二頁，2022年，8月28日

教學(xué)目標(biāo)及要求

1、掌握高效液相色譜法的特點(diǎn)及適用范圍，與GC及經(jīng)典LC的異同。2、掌握高效液相色譜儀的主要部件及基本流程。3、理解常用檢測器的原理、適用的分析對(duì)象及適用范圍。4、理解各種分離方式的原理及選擇原則。5、了解高效毛細(xì)管電泳基本原理、儀器及特點(diǎn)。6、了解紙層析和薄層層析分離過程、操作技術(shù)及特點(diǎn)。3第三頁，共五十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)概述

高效液相色譜（HPLC）是一種以液體為流動(dòng)相的快速分離分析色譜技術(shù)，采用細(xì)微粒固定相、高壓輸液泵和高靈敏度檢測器，具有高壓、高速、高效、高靈敏度的特點(diǎn)，對(duì)于那些沸點(diǎn)高，熱穩(wěn)定性差，相對(duì)分子質(zhì)量大的有機(jī)化合物如烷烴、烯烴、芳烴、染料、甾族化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等均可進(jìn)行分離分析。

按照固定相不同分為：液液分配色譜；吸附色譜（液固色譜）；離子交換色譜；尺寸排阻色譜（凝膠滲透色譜）；離子色譜、平板色譜（薄層色譜）等。4第四頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較高壓：HPlC供液壓力和進(jìn)樣壓力都很高（150～350X105Pa）。高壓是的一個(gè)突出特點(diǎn)。高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時(shí)數(shù)小時(shí)。高效：填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高。可以在數(shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。高靈敏度：檢測器靈敏度極高：UV——10-9g,熒光檢測器——10-11g。5第五頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.HPLC與GC的比較分析對(duì)象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定有機(jī)化合物（占總數(shù)的20%）；HPLC可分析高沸點(diǎn)、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定有機(jī)化合物（占80%）。流動(dòng)相的選擇：GC采用的流動(dòng)相為幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用，對(duì)組分作用小；HPLC采用的流動(dòng)相為液體或各種液體的混合（供選擇的機(jī)會(huì)多）。它除了起運(yùn)載作用外，還可與組分作用，并與固定相對(duì)組分的作用產(chǎn)生競爭，即流動(dòng)相對(duì)分離的貢獻(xiàn)很大，可通過溶劑來控制和改進(jìn)分離。操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進(jìn)行。6第六頁，共五十二頁，2022年，8月28日3.應(yīng)用極性增加不溶于水溶于水非極性離子非離子極性吸附反向分配分配正向分配離子交換尺寸排阻凝膠滲透凝膠過濾分子量7第七頁，共五十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)

HPLC儀器8第八頁，共五十二頁，2022年，8月28日HPLC儀器包括：高壓輸液裝置→進(jìn)樣系統(tǒng)→分離系統(tǒng)→檢測系統(tǒng)此外還配有梯度淋洗、自動(dòng)進(jìn)樣和數(shù)據(jù)處理裝置。梯度淋洗9第九頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.高壓輸液系統(tǒng)1）貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過濾器(Ni合金)，其孔徑約2m，可防止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)。2）脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過脫氣器中的脫氣膜，相對(duì)分子量小的氣體透過膜從溶劑中除去。3）高壓泵：要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無脈動(dòng)、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕。輸液泵種類：恒壓型和恒流型。10第十頁，共五十二頁，2022年，8月28日4）梯度淋洗裝置：作用是在分離過程中，按一定的程序連續(xù)改變流動(dòng)相中多種不同性質(zhì)溶劑的配比，以改變流動(dòng)相的極性、離子強(qiáng)度或酸度等，從而提高試樣的分離效率，縮短分析時(shí)間，使色譜峰形得到改善，提高測定的靈敏度和定量的準(zhǔn)確度。11第十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.進(jìn)樣系統(tǒng)1）隔膜注射進(jìn)樣：使用微量注射器進(jìn)樣。裝置簡單、死體積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差。2）高壓進(jìn)樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好。裝入樣品出口進(jìn)樣采樣環(huán)泵入溶劑進(jìn)色譜柱12第十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日3.色譜柱1）要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長多為15~30cm，內(nèi)徑為4~5mm；2）柱的填充：主要采用勻漿法。填充方法：填充時(shí)，將制作好的勻漿液，用流動(dòng)相充滿色譜柱及其延長管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填充速度快（防凝聚、沉降或結(jié)塊）、且無空氣進(jìn)入（影響填充均勻性）。13第十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日4.檢測器1）紫外檢測器

依據(jù)被分析組分對(duì)特定紫外光的選擇性吸收。最小檢測量10-9g·mL-1，對(duì)流量和溫度的波動(dòng)不敏感，可用于梯度洗脫。14第十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日光電二極管陣列檢測器15第十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日波長可的松氟美松皮質(zhì)酮快速掃描—光電二極管陣列（PDA）檢測所獲得的三維色譜-光譜圖16第十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對(duì)光的折射率不同。為通用型檢測器，靈敏度為10-7g/mL。但對(duì)溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗。光源調(diào)零光學(xué)零參比樣品平面鏡透鏡光電轉(zhuǎn)換記錄儀放大器遮光板2）示差折光檢測器17第十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日3）熒光檢測器

根據(jù)某些物質(zhì)受激后能產(chǎn)生一定強(qiáng)度熒光的性質(zhì)，可制成靈敏度極高的熒光檢測器。它是一種選擇性很強(qiáng)的檢測器，其靈敏度比UV檢測器高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。適合于稠環(huán)芳烴、甾族化合物、酶、氨基酸、維生素、色素、蛋白質(zhì)等熒光物質(zhì)的測定。

4）電導(dǎo)檢測器

主要用于離子色譜的檢測。

原理：基于待測物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來測量電離物質(zhì)的含量。18第十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日第三節(jié)高效液相色譜法的類型及分離原理

一、吸附色譜（液－固吸附色譜）

二、分配色譜三、離子交換色譜

四、體積排阻色譜高效液相色譜法的分類19第十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日一、吸附色譜（液－固吸附色譜）吸附色譜是基于各組分在固體吸附劑表面上具有不同吸附能力而進(jìn)行分離。以固體吸附劑為固定相，如極性的硅膠、氧化鋁、分子篩和非極性的活性炭等（較常使用硅膠）。流動(dòng)相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。宜于分離極性不同或含極性基團(tuán)相同但數(shù)目不同的試樣，也適于分離異構(gòu)體，但不宜于分離同系物。

20第二十頁，共五十二頁，2022年，8月28日二、分配色譜（液－液分配色譜）原理

根據(jù)各待測物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，這種分配平衡需進(jìn)行多次，造成各待測物的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離的過程。21第二十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.流動(dòng)相根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜和反相分配色譜。正相分配色譜：流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離。反相分配色譜：流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離。22第二十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日3.固定相原則上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有幾種，按極性由高到低為：,’-氧二丙腈（ODPN)、聚乙二醇（PEM）、角鯊?fù)椋⊿Q）。早期通過在擔(dān)體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相（通過化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點(diǎn)

）。23第二十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日正相色譜低極性流動(dòng)相反相色譜高極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間待測物極性：A>B>C正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系24第二十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日三、離子交換色譜此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)相結(jié)合，測定各類陰、陽離子的分離分析方法。它既適于無機(jī)離子，也適于有機(jī)物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等。1.

原理：利用不同待測離子對(duì)固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來實(shí)現(xiàn)分離的。25第二十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.固定相按離子交換劑類型分四種：26第二十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型離子交換層惰性核惰性核離子交換劑硅膠層涂覆按固定相制作方法可分為：27第二十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日3.流動(dòng)相離子交換色譜流動(dòng)相為無機(jī)酸或無機(jī)堿的鹽類緩沖溶液（有一定pH和離子強(qiáng)度），通過改變pH、緩沖劑類型、離子強(qiáng)度、加入有機(jī)試劑和配位劑等條件來控制分配比k，改變交換劑的選擇性，進(jìn)而影響樣品待測物的分離。28第二十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日29離子色譜（IC）

以無機(jī)、特別是無機(jī)陰離子混合物為主要分析對(duì)象。第二十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日30離子色譜的原理:采用交換容量非常低的特制離子交換樹脂為固定相；在分離柱后，用另外一支抑制柱來消除淋洗液的高本底電流;采用電導(dǎo)檢測器檢測流出組分?？焖俜蛛x分析微量無機(jī)離子混合物;各種抑制裝置及無抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。第三十頁，共五十二頁，2022年，8月28日31例如：分析陽離子時(shí)，以無機(jī)酸為流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，則發(fā)生下列反應(yīng)：R+—OH+HCl(流動(dòng)相)——R+—Cl-+H2O

R+—OH+MCl(待測物)——R+—Cl+M+OH-

可見，不僅大量酸轉(zhuǎn)化為低電導(dǎo)的水，而且待測離子轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的堿。離子色譜的原理:第三十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日32離子色譜的特點(diǎn)：分析速度快：可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個(gè)試樣的分析；分離能力高：在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物分離；

分離混合陰離子（NO3—、NO2－、SO42－、PO43－等）惟一快速、靈敏、準(zhǔn)確的最有效分析方法。缺點(diǎn)：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過抑制柱后會(huì)展寬，降低分離度。第三十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日四、尺寸排阻色譜法

又稱凝膠（滲透）色譜，主要用于大分子的分子分離。它是基于待測物分子的尺寸和形狀不同來實(shí)現(xiàn)分離的。1、分離原理：固定相為化學(xué)惰性的多孔凝膠，它類似于分子篩，但孔徑更大。凝膠內(nèi)有一定大小的空穴，分子體積大的待測物不能滲入孔穴中而被排阻，較早地被淋洗出來，中等的部分滲透，小分子則完全滲透，最后流出色譜柱。即待測物分子按分子大?。ǚ肿恿看笮。┫群髲闹辛鞒?。33第三十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.固定相3.流動(dòng)相的要求：能溶解樣品且與凝膠相似（潤濕凝膠）、粘度?。ㄔ黾訑U(kuò)散速度）。

34第三十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日第四節(jié)色譜分離方法的選擇一般可根據(jù)試樣相對(duì)分子質(zhì)量范圍、溶解度及分子結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分離方法的初步選擇。一、根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量選擇二、根據(jù)溶解性選擇三、根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇35第三十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日36第三十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日第五節(jié)高效毛細(xì)管電泳簡介一、基本原理1、概述在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同可實(shí)現(xiàn)分離。37第三十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日

毛細(xì)管電泳是以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)試樣中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離、分析物質(zhì)的一類液相技術(shù)，是經(jīng)典電泳和現(xiàn)代微柱分離的結(jié)合。38第三十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日2、電泳現(xiàn)象與電滲流現(xiàn)象電泳現(xiàn)象：帶電離子在電場作用下的遷移（定向移動(dòng)），速度ν電泳39第三十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日電滲流現(xiàn)象：石英玻璃表面存在硅羥基，pH>3時(shí),形成雙電層，在高電場的作用下，雙電層中的水合陽離子引起毛細(xì)管中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度ν電滲流40第四十頁，共五十二頁，2022年，8月28日3、分離過程：41第四十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日4、分離類型

毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）：最普遍、最基本的一種分離模式。42第四十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）：將聚丙烯酰胺在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高?？煞蛛x測定蛋白質(zhì)、DNA等。43第四十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日毛細(xì)管膠束電動(dòng)力學(xué)色譜（MECC）：

用來分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍。

44第四十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日二、儀器裝置45第四十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日

電壓：0～30KV。分離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測器（10-19～10-21mol/L）46第四十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日三、主要特點(diǎn)和應(yīng)用高分辨率：理論n高達(dá)數(shù)百萬塊，甚至數(shù)千萬塊；高靈敏度：可檢測出低至10-21

mol/L濃度的物質(zhì)；高分析速度：可在3分鐘內(nèi)分離30種陰離子；1.7分鐘分離19種陽離子；4分鐘可分離10種蛋白質(zhì)；試樣用量少：僅需幾nL（10-9

L）的試樣；儀器簡單，操作成本低：分析一個(gè)試樣僅需幾毫升流動(dòng)液。47第四十七頁，共五十二頁，2