液相色譜儀介紹

液相色譜儀介紹第一頁，共八十三頁，2022年，8月28日高效液相色譜法

液相色譜是色譜中的一類分離與分析技術，其特點是以液體作為流動相。對于大量有機化合物、離子型化合物以及易受熱分解或失去活性的物質，不能直接或不適合用氣相色譜方法進行分析，因此高效液相色譜的應用領域不斷擴大和深入。特別是近幾十年來，液相色譜固定相的高度發(fā)展，儀器不斷更新，高效液相色譜目前已成為許多學科科學研究和日常分析的重要手段。第二頁，共八十三頁，2022年，8月28日一、高效液相色譜法的特點

1、高效液相色譜可以分離分析高極性，高分子量和離子型的各種物質，只要被分析對象能夠溶解于可作為流動相的溶劑中并能夠被檢測，就可以直接進行分析。某些目前尚不能被直接檢測，或檢測靈敏度不夠的，也可以采用各種衍生技術，實現這些物質的檢測。2、高效液相色譜儀主要由高壓輸液泵、進樣閥、柱子和檢測器等組成。3、柱子的柱效（以理論板數計）很高，每米可達3萬塊以上。一般只使用20～25cm長的柱子。由于填料的不斷發(fā)展和改進，目前最短的柱子只有3cm長，板數可達3000～4000。已能夠滿足一般分析的需要，并具有很高的分析速度。第三頁，共八十三頁，2022年，8月28日4、高效液相色譜儀通常在室溫下操作，樣品一般不須預處理，操作簡便，很容易掌握。5、高效液相色譜操作的難點在于流動相的選擇。可以采用純溶劑，二元或多元混合溶劑作流動相。但流動相的選擇必須遵循一定的規(guī)律，并以科學的方法優(yōu)選。6、高效液相色譜技術也存在一些問題。柱子價格昂貴，要消耗大量的溶劑，而且許多溶劑對人體是有害的。高效液相色譜儀的價格和損耗也比氣相色譜儀高。此外，尚缺少象氣相色譜中氫火焰離子化檢測器那樣的通用型、高靈敏度的檢測手段。因此，高效液相色譜無論在技術上，在理論上，還是在應用上都處于發(fā)展階段。第四頁，共八十三頁，2022年，8月28日二、高效液相色譜系統(tǒng)

下圖是高效液相色譜系統(tǒng)的示意圖。 它由輸液泵為核心的輸液系統(tǒng)、進樣器、柱子和檢測器四個基本部分組成。實際儀器比圖要復雜得多，它們可能有幾個泵，幾種檢測器，自動進樣系統(tǒng)，柱和檢測器的溫度控制系統(tǒng)等。

第五頁，共八十三頁，2022年，8月28日1、

輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)的作用是向柱子提供壓力高，流速穩(wěn)定的流動相。它以高壓輸液泵為核心，由溶劑儲槽、過濾器、輸液泵、梯度溶劑混合器等組成。為了測量系統(tǒng)流量和壓力，在輸液系統(tǒng)的輸出通路上還安裝了不同類型的傳感元件。①儲液槽儲液槽是盛裝溶劑的容器。它可以是一個普通的溶劑瓶，或是一個專門設計的儲液槽，用于除去溶劑中的氣體。 ②過濾器各種泵的柱塞、進樣閥的閥芯加工的精密度都非常高，微小的機械雜質將導致這些部件的損壞，而不能很好的工作。同時雜質在柱頭的積累還影響柱子的使用，增大柱壓，因此過濾溶劑，設置過濾器是必須的。過濾器的芯子通常是一個由多孔聚四氟乙烯制成的具有一定空隙度的圓柱體，鑲嵌在一個不銹鋼的殼體中，形成一個完整的、安裝方便的部件。第六頁，共八十三頁，2022年，8月28日③高壓輸液泵高壓輸液泵是現代液相色譜裝置中最關鍵的設備，輸出高壓溶劑是實現快速分析的前提。除了最高使用壓力外，還有線性流量范圍，輸出流量的精確度，泵的操作方式，流量輸出或壓力恒定的穩(wěn)定性，以及易于操作和維修等。高效液相色譜儀中所用的泵可分為兩類：恒壓泵和恒流泵。恒壓泵主要指氣動放大泵，泵出口壓力在系統(tǒng)中是恒定的，流速由柱的阻力決定。恒流泵有往復泵和注射泵，這類泵輸出的溶劑流量恒定，柱前的壓力由柱后的阻力確定。目前使用最多的是往復泵。第七頁，共八十三頁，2022年，8月28日④梯度洗脫裝置當樣品是一個含有不同種類組分的復雜混合物時，通常用一種純的或固定組成的混合溶劑難以實現滿意的分離，往往是先溜出來的峰分不開，而后溜出來的峰保留時間太長。因此，在液相色譜中常在一個樣品的分析過程中，不斷調整混合溶劑的組成，改變溶劑強度或溶劑的選擇性。如果溶劑組成隨洗餾時間按一定規(guī)律變化，稱這種洗餾過程為梯度洗脫。梯度洗脫過程溶劑組成的變化可以是線性的，也可以是非線性的；可以是二元的，也可以是三元，甚至多元溶劑的混合。梯度洗脫裝置根據溶劑混合時的壓力分為兩種類型：低壓梯度和高壓梯度。第八頁，共八十三頁，2022年，8月28日低壓梯度是溶劑在常壓下混合，然后用一個高壓輸液泵把它輸送至柱系統(tǒng)中。多元溶劑在混合室或溶劑罐中混合，并以一定速度改變溶劑的組成。這種方式簡單、經濟，只能用往復泵。高壓梯度使用兩臺高壓輸液泵，每臺輸送一種溶劑，兩臺泵輸出的溶劑在一個混合室內混合。每臺泵的溶劑流量由獨立的電路或計算機控制，它們按一定比例改變。對于梯度系統(tǒng)系統(tǒng)來說，關鍵是要保證流速的穩(wěn)定，梯度洗脫洗脫重現性好。因此混合室的體積應盡可能地小，且不存在死角。第九頁，共八十三頁，2022年，8月28日進樣裝置在液相色譜中，進樣方式有微量注射器進樣，進樣閥進樣，自動進樣裝置等。高效液相色譜最主要的特點要求進樣器設計要耐高壓，死體積小，與溶劑接觸的部分具有很好的耐蝕性。進樣口處的隔墊把系統(tǒng)和外界分開。為了使隔墊能承受上百公斤的壓力，頂蓋的通孔很細，而且長。在系統(tǒng)處于高壓時，用一根金屬棒壓住隔墊的通孔部分，避免內部壓力太大把隔墊沖破。液相色譜的進樣口目前大部分都是采用六通閥，六通閥進樣的原理如圖所示。第十頁，共八十三頁，2022年，8月28日

進樣時樣品中不應混入雜質。溶解樣品的溶劑最好和使用的流動相一致，以防止溶劑變化出現不溶物而堵塞柱子。第十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日檢測器檢測器在色譜系統(tǒng)中非常重要。因為液相色譜系統(tǒng)的所有特性都通過檢測器的輸出信號表現出來。目前液相色譜儀常備的檢測器主要是紫外分光光度計和光二極管陣列檢測器，示差折光儀，熒光檢測器。紫外和示差折光檢測器是液相色譜最基本的檢測器，下面介紹這兩種檢測器的工作原理。第十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日紫外、可見－紫外分光檢測器這種檢測器在液相色譜中應用最廣。幾乎是一切色譜儀必備的檢測器，它的特點是：噪音低、具有相對高的靈敏度、結構簡單、易于維修。紫外檢測器的工作原理是：當一束紫外光通過樣品池時，入射光的一部分被溶液中的某種物質吸收，吸收的多少取決于溶質的性質。溶質的濃度和響應值之間存在線性關系。紫外檢測器有固定波長檢測器，可變波長檢測器兩種。可變波長檢測器采用氘燈或氘燈與鎢絲組合的光源，波長在190～800nm范圍可調。第十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日示差折光檢測器示差檢測器的工作原理每一種物質在一定的溫度、壓力等條件下都有固定的折光指數。樣品組分從柱中洗餾出來與流動相組成一混合物，它的折光指數與純流動相或純溶質都不相同。示差折光檢測器就是以純溶劑作參照物，連續(xù)監(jiān)測柱后洗餾物折光指數的變化，并根據變化的差值決定樣品中各組分的量由于折光指數具有加合性，任何溶劑都具有一定的折光指數，因此對所有物質都有響應，是通用型檢測器。第十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日三、高效液相色譜柱

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柱型 目前液相色譜常用的標準柱型是內徑為4.6或3.9mm,長度為20～25cm的不銹鋼柱。柱流動相的體積流速是每分鐘1ml左右。填料顆粒度5～10μm，柱效以理論板數計大約在7000～10000。液相色譜柱發(fā)展的趨勢，一是減少顆粒度（3～5μm）提高柱效，縮短柱長，提高分析速度。另一方面是減小柱徑，節(jié)省溶劑用量，提高檢測濃度，特別是用于復雜組分的分析。第十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日2、

柱的選擇性柱的選擇性主要指柱固定相對分離的控制。固定相對不同類型的化合物有一定的選擇性。選擇固定相的一般標準還是以“相似相溶”原理為基礎。如果溶質溶于烴類溶劑，表明它是低極性化合物，這樣就可以選用非極性或亞極性固定相。若樣品溶于極性溶劑中，如醇類，則可選擇極性固定相，也可以選擇非極性固定相。實際上，在液相色譜中，由于每一種分離方法所用固定相的種類很少，分離主要靠溶劑的選擇。由于十八烷基（ODS或C18）柱能夠用于多種化合物的分離，因此它是最常用的固定相。第十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日3、

柱效的評價要實現對溶質分離，要求柱子具有很高的柱效。影響柱效的因素很多，對柱效的評價也就比較難，一般是測定它們的理論板數n，板數n主要依賴于保留時間（tR）與峰底寬度（Wb）的比值。Wb越窄，這項比值越大，柱效越高。同時還要考慮柱的滲透性，即操作條件下的最小進口壓力，以及峰的對稱性。商品柱子在出廠時都附有一張標準譜圖，根據所標明的條件，得到重復的譜圖，說明這根柱子是合格的。柱子經過長期使用或保存不當，柱子的性能會下降。突出的表現是在給定溶質和溶劑等操作條件下，峰變寬且對稱性不好，可K’值下降。第十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日計算峰不對稱性的方法見圖，峰不對稱性因子是在峰高10％處測量的。如果柱子引起峰的不對稱性大于1.2，說明改柱子的質量不好了，若超過1.6，則這根柱子就不能再使用了。第十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日四、液相色譜流動相及其選擇性

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流動相的作用 在給定固定相的情況下，溶質的保留和對溶質的分離主要由溶劑的性質決定。在液相色譜中，溶劑可以是非極性的，也可以是極性的。如果與固定相的極性相比，溶劑極性小于固定相的，稱這種色譜過程為正相液相色譜。如硅膠作為固定相，正己烷作為流動相的吸附色譜過程。如果與此相反，溶劑的極性大于固定相，如以ODS鍵合相作為固定相，水和甲醇等作為流動相的分配色譜過程，稱為反相液相色譜。有的固定相，如－NH2基鍵合相，可以使用非極性溶劑，極性溶劑，PH2~7的磷酸緩沖液作為流動相。因此，正相與反相的概念是相對的，取決于兩相極性的比較。 在液相色譜中溶劑還用來溶解樣品，并用于樣品的預處理中?？傊軇┰谝合嗌V中是非常重要的，不應和氣相色譜中的載氣比較，因為后者只起攜帶樣品的作用。第十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日2、

作為流動相的溶劑性質溶劑的種類和數目是很多的，但是可作為流動相的溶劑的數目相對來說是很少的，說明溶劑的選擇在液相色譜中是比較不容易的。1－所有的溶劑；2－具有合適物理性質的溶劑；3－K’值合適的溶劑；4－值合適的溶劑第二十頁，共八十三頁，2022年，8月28日可作為流動相的溶劑至少應該具備如下一些性質：①、溶劑具有穩(wěn)定的化學性質。它不能和固定相發(fā)生不可逆的化學反應，也不引起固定相表面活性基團的流失及基質的溶漲。除特殊的分配過程，溶劑只溶解樣品，而不發(fā)生化學反應。②、溶劑的選擇與使用的檢測器要有相溶性。在使用紫外檢測器時，溶劑應該在選定的紫外區(qū)沒有吸收，或在溶質最大吸收波長段沒有吸收。使用示差折光檢測器時，溶質和溶劑的折光指數應有較大的差別，否則檢測靈敏度不夠高。③、溶劑粘度既影響系統(tǒng)的壓降，也影響分析時間。因此使用粘度小的溶劑作為流動相在降低操作成本和加速分析時間方面具有明顯的意義。第二十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日④溶劑可以從市場買到并易于純化。在某些分析中，特別是檢測靈敏度高時，溶劑的純度要求很高，所以溶劑應易于獲取并易于純化。⑤溶劑的沸點不應太低。如果沸點太低在溶劑傳輸過程中易出現氣泡，它將影響輸送流量的精度和混合溶劑的組成。⑥溶劑的毒性應盡可能小，并不易起火。大多數溶劑對人體都是有害的，因此操作者應該注意溶劑使用中的各種安全措施。⑦成本低。使用液相色譜分離或分析樣品要消耗大量的溶劑，這些溶劑使用后一般都不再回收，因此應盡可能使用低成本溶劑。第二十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日3、

常用的溶劑在日常工作中比較常用的溶劑是有限的十幾種，如表中列出的16種常用溶劑的性質，其它可選擇的溶劑還有：異丙醇、丁醇、異丁醇、環(huán)己烷、乙醚等。在液相色譜中不僅使用純溶劑，更經常使用二元或多元溶劑的混合流動相，以調節(jié)流動相的洗脫強度或流動相的選擇性。第二十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日4、

緩沖溶液和流動相添加物在色譜分離過程中常使用緩沖溶液作為流動相，有時只在流動相中添加少量的酸，以保持流動相的氫離子濃度（PH值），提供一定的離子強度。它通過控制酸性或堿性化合物的離解度或絡合物的絡合常數，達到調整保留時間和分離的目的，也有助于某些化合物峰形的改善。

常用的酸是磷酸、醋酸及其它弱酸。緩沖液是這些酸和它們的鹽所構成的水溶液。一般是先確定鹽的濃度，通過加入酸的辦法調整合適的PH值。磷酸的PH值范圍為3.7～5.6，5.8~8.0，醋酸的PH值范圍在1.8~3.5之間。選擇介質和PH值除了考慮被分析樣品外，還要考慮色譜系統(tǒng)所用的材料及固定相承受的能力。因為普通色譜系統(tǒng)使用的材料，包括柱管、泵和檢測器等，主要是不銹鋼，因此對不銹鋼有侵蝕作用的酸不宜選用。以硅膠為基體的固定相，PH值在2～7之間，高于或低于這個范圍，由于固定相的不穩(wěn)定會失去分離效能。流動相添加物主要指為了某些化合物的分離在流動相中添加一些物質，這些物質與被分析化合物通過共價鍵、氫鍵、偶極矩的相互作用形成各種形式的絡合物、鰲合物等改變其原有的化學性質，達到分離的目的。在流動相添加手性試劑，利用非手性固定相可獲得旋光異構體的分離等。在流動相中添加少量精心選擇的試劑，不僅改善了某些化合物的分離，也擴大了色譜的應用范圍。第二十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日5、

液相色譜的分離度液相色譜過程的最終目的是實現多組分混合物的分離。色譜中用分離度（R）衡量相鄰物質峰的分離程度，它的定義是

R=

ΔtR/

WbΔtR是相鄰一對物質的保留時間差（tR2－tR1），Wb是它們峰低寬度的平均值（Wb1＋Wb2）/2。R=1表明兩種溶質基本被分開。R=1.5時實現完全分開。要改善分離度，最好的辦法是選擇合適的溶劑。第二十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日6、

梯度洗脫在液相色譜分離過程中不斷改變溶劑組成的方法稱為梯度洗脫。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，保持好的峰形，增加溶劑的選擇性，保證多組分的分離，提高樣品中各物質的分離程度。第二十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日五、柱子的維護高效液相色譜柱子的價格很高，要維持柱子較長的使用壽命應注意以下幾點：1、

固定相對流動相的要求，如溶劑的化學性質、溶液的PH值等2、

在使用緩沖溶液時，鹽的濃度不應過高，且日工作結束后要及時用純溶劑清洗柱子，不應過夜。3、

樣品量不應過載，臟樣品應預處理，最好使用預柱保護分析柱。4、

當柱前壓力增加或基線不穩(wěn)時，往往是柱子被玷污所致，可通過改變溶劑的辦法使不溶物溶解，柱子再生。正相柱使用水，甲醇等極性溶劑，反相柱使用氯仿或氯仿與異丙醇的混合溶劑。5、

柱子應該永遠保存在溶劑中，鍵合相最好的溶劑是乙腈。水和醇或它們的混合物都不是最好的選擇。第二十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日六、溶劑脫氣 在常溫、常壓下水和有機溶劑都溶解一定量的氣體，如果不除去可能帶來許多問題。如：產生氣泡、空氣中的氧可能導致檢測器的噪音，靈敏度下降或者它們會氧化分析物，損壞柱子。因此溶劑在使用前需要脫氣。第二十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日七、高效液相色譜操作規(guī)程第二十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日第三十頁，共八十三頁，2022年，8月28日第三十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日第三十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日第三十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日第三十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日第三十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日第三十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日第三十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日方法編輯、保存第三十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日第三十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日第四十頁，共八十三頁，2022年，8月28日第四十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日第四十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日第四十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日第四十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日第四十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日第四十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日第四十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日第四十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日第四十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日第五十頁，共八十三頁，2022年，8月28日第五十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日第五十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日第五十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日第五十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日第五十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日第五十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日第五十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日第五十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日第五十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日第六十頁，共八十三頁，2022年，8月28日第六十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日第六十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日第六十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日第六十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日第六十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日第六十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日第六十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日案例分析一天麻素的高效液相色譜分析條件液相色譜儀:Agilent1200;配置：四元梯度泵，DAD檢測器，柱溫箱，自動進樣器。色譜柱：AgilentZorbaxSB-Aq,250×4.6cm，5μm；檢測波長：220nm；進樣量：10μl；柱溫：28.0℃；流動相：乙腈：0.05%磷酸溶液=3:第六十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日案例分析一第六十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日案例分析一第七十頁，共八十三頁，2022年，8月28日案例分析二甘草苷的高效液相色譜分析甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch的干燥根及根莖。是一味補益中草藥，功能主治：補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，調和諸藥。甘草的主要成分是甘草酸（glycyrrhizicacid），分子式C42H62O16。又稱甘草甜素。為甘草次酸的二葡萄糖醛苷（見苷），是甘草的甜味成份。它具有抗炎、抗病毒，和保肝解毒及增強免疫功能的作用。臨床被廣泛用于治療各種急慢性肝炎、支氣管炎和艾滋病，還具有抗癌防癌、干擾素誘生劑及細胞免疫調節(jié)劑等功能。我們可利用高效液相色譜法測定甘草酸的含量。第七十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日案例分析二分析條件液相色譜儀:Agilent1200;配置：四元梯度泵，DAD檢測器，柱溫箱，自動進樣器。色譜柱：AgilentZorbaxSBC18，,150×4.6cm，5μm；檢測波長：276nm；進樣量：10μl；柱溫：28.2℃；流動相：乙腈：0.5%冰醋酸溶液=20:80第七十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日案例分析二第七十三頁，共八十三