雷公藤單萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表達(dá)分析

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[摘要]該研究克隆得到1條雷公藤單萜合酶基因TwMS。其完整開放閱讀框?yàn)?797bp，編碼579個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為69.75kDa、理論等電點(diǎn)為5.37。生物信息學(xué)分析說明，TwMS具有單萜合酶的特征布局域，屬于萜類合酶TPSb亞家族。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，經(jīng)茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)后，TwMS的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，并在24h達(dá)成最高。此外，該研究在大腸桿菌BL21（DE3）中告成表達(dá)TwMS蛋白，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了根基。

[關(guān)鍵詞]雷公藤；單萜合酶；生物信息學(xué)分析；基因表達(dá)分析；蛋白表達(dá)

CloningandproteinexpressionanalysisofmonoterpenesynthasegeneTwMSinTripterygiumwilfordii

HUTianyuan1，SUPing2，ZHANGYifeng1，2，GUANHongyu1，2，ZHOUJiawei1，

TONGYuru1，2，GAOWei1*，HUANGLuqi2

（1.KeyLaboratoryofCollateralDiseases，SchoolofTraditionalChineseMedicine，CapitalMedicalUniversity，

Beijing100069，China；

2.StateKeyLaboratoryofDaodiHerbs，NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica，Chinese

AcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China）

[Abstract]Inthisstudy，weclonedamonoterpenesynthases，TwMSfromTripterygiumwilfordiisuspensioncells.TwMSgenecontaineda1797bpopenreadingframe（ORF），encodingapolypeptideof579aminoacids，whichdeducedisoelectricpoint（pI）was6.10andthecalculatedmolecularweightwas69.75kDa.BioinformationanalysisshowedthatthesequenceofTwMSwasconsistentwiththefeatureofmonoterpenesynthases.DifferentialexpressionanalysisrevealedthattherelativeexpressionlevelofTwMSincreasedsignificantlyafterbeinginducedbymethyljasmonate（MeJA）.Thehighestexpressionleveloccurredat24h.TwMSproteinwassuccessfullyexpressedinEscherichiacoliBL21（DE3），whichlaidthefoundationforidentifyingthefunctionofT.wilfordiimonoterpenesynthases.

[Keywords]Tripterygiumwilfordii；monoterpenesynthases；bioinformaticsanalysis；mRNAexpressionanalysis；proteinexpression

中藥雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.f.來(lái)源于衛(wèi)矛科植物雷公藤的根或根的木質(zhì)部，具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛、活血消腫，殺蟲解毒等成果。現(xiàn)代研究說明，雷公藤的藥用活性成分萜類物質(zhì)具有顯著的抗炎、抗腫瘤、調(diào)理免疫等藥理活性[1]，其主要活性成分包括二萜類成分雷公藤甲素和三萜類成分雷公藤紅素等。其中雷公藤甲素可有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)胰腺癌的治療效果顯著[23]，此外，雷公藤甲素還具有神經(jīng)養(yǎng)分活性，是治療帕金森和老年癡呆等疾病的重要活性分子[45]。雷公藤紅素除了具有神經(jīng)養(yǎng)護(hù)作用和抗遺傳性疾病等作用外，近年來(lái)還被報(bào)導(dǎo)是一種瘦素增敏劑，可以起到減肥的作用[6]。

單萜化合物是由2個(gè)異戊二烯布局單元組成的鏈狀或環(huán)狀化合物，廣泛存在于植物揮發(fā)油和樹脂中[7]。單萜化合物多具有較強(qiáng)的香氣和生物活性，在植物種群競(jìng)爭(zhēng)、吸引昆蟲傳粉、防衛(wèi)植食性動(dòng)物和操縱病蟲害發(fā)生等方面發(fā)揮著重要作用[810]。植物單萜由質(zhì)體內(nèi)的4磷酸2甲基赤蘚糖（2CmethylDerythritol4phosphate，MEP）途徑合成，其前體物質(zhì)為牻牛兒基焦磷酸（geranyldiphosphate，GPP）。單萜合酶（monoterpenesynthases，monoTPS）是單萜生物合成的關(guān)鍵酶，單萜合酶基因的表達(dá)是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中所務(wù)必的，具有明顯的時(shí)空表達(dá)規(guī)律，其基因家族的不同成員往往在組織或器官的特定發(fā)育階段表達(dá)，以合成植物通訊和生物防衛(wèi)所需的化感物