高通量測序技術在腫瘤診斷中的應用

2016年06月

高通量測序技術在腫瘤診斷中的應用報告提綱一、高通量測序技術臨床應用基礎二、高通量測序與腫瘤個體化診治三、思考與挑戰(zhàn)一、高通量測序腫瘤臨床應用基礎腫瘤的高發(fā)病率和死亡率前十大腫瘤發(fā)病占腫瘤整體發(fā)病比例76.39%前十大腫瘤死亡占腫瘤整體發(fā)病比例84.27%*每10萬人發(fā)病人數(shù)；**每10萬人死亡人數(shù)發(fā)病率*每年新發(fā)4,292,000人死亡率**每年死亡2,814,000人肺癌，54人胃癌，36人結(jié)直腸癌，29人肝癌，29人食管癌，22人乳腺癌，21人胰腺癌，7人淋巴癌，7人膀胱癌，7人甲狀腺癌，7人肺癌，46人肝癌，26人胃癌，26人食管癌，17人結(jié)直腸癌，14人胰腺癌，7人乳腺癌，5人白血病，4人腦癌，4人淋巴癌，4人ChenW,ZhengR,BaadePD,etal..CACancerJClin,2016Thisisamapfor22cancerregistries(datafrom2000to2011)Thisisamapfor72cancerregistries(datafrom2009to2011)高通量測序的應用領域全基因組測序外顯子組測序轉(zhuǎn)錄組測序小RNA測序表觀基因組分析應用高通量測序的實際檢測靈敏度取決于最終測序深度突變增殖轉(zhuǎn)移擴散腫瘤在個體和群體內(nèi)的異質(zhì)性EdwardJ.FoxandLawrenceA.Loeb.Nature.2014,512(7513):143–144不同個體間的異質(zhì)性不同部位腫瘤細胞的異質(zhì)性同一腫瘤不同細胞的異質(zhì)性發(fā)生的區(qū)域的異質(zhì)性（空間）原發(fā)和次生的異質(zhì)性（時間）不同突變位點的異質(zhì)性（基因）腫瘤治療理念的轉(zhuǎn)變美國癌癥研究學會（AmericanAssociationforCancerResearch，AACR）Meeting,2014同癌異治（UmbrellaTrial）異癌同治（BasketTrial）ZardavasD,Piccart-GebhartM.ASCO.AmericanSocietyofClinicalOncology.2015:e183-90HymanDM,SolitDB,ArcilaME,.DrugDiscovToday.2015.pii:S1359-6446(15)00321-9帶有相同基因靶點的不同腫瘤給予相同治療例如：研究顯示，維羅非尼（Vemurafenib）對BRAFV600突變的黑色素瘤和非黑色素瘤均取得良好療效含有不同基因靶點的同一腫瘤采用不同的治療例如：NCCN指南顯示，對于乳腺癌，HR+建議服用依維莫司（Everolimus）；HR-建議服用托瑞米芬（Toremifene）癌癥基因組圖譜項目（TCGA）/TCGA計劃試圖采用大規(guī)?；蚪M測序，繪制腫瘤基因組變異圖譜，并進行系統(tǒng)分析，找到所有致癌和抑癌基因的微小變異。TCGA是HGP完成后更大型的高通量測序應用。癌癥基因組圖譜（TheCancerGenomeAtlas,TCGA）計劃是由美國國家癌癥研究所和美國國家人類基因組研究所于2006年啟動的大型研究。TCGA包含了來自16個國家150多位研究人員的科學貢獻，表征了來自超過25種不同癌癥的100,00份腫瘤。數(shù)據(jù)包括1000萬個突變，TCGA數(shù)據(jù)已被用來尋找新的突變，定義固有的腫瘤類型，確定泛癌癥的異同，揭示耐藥機制和收集腫瘤進化的證據(jù)。ICGC與國際腫瘤基因組計劃LedfordH.Nature.2010;464(7291):972-4

ICGC與國際腫瘤基因組計劃LedfordH.Nature.2010;464(7291):972-4

國際腫瘤基因組協(xié)作聯(lián)盟(ICGC)于2007年成立并啟動了全球范圍腫瘤基因組研究工作。ICGC提出對50種癌癥、總計25000例患者樣本繪制體細胞基因突變譜。

當前跨癌種的泛癌癥基因組研究成為ICGC工作重點。我國科學家是ICGC創(chuàng)始成員之一，并組建了“中國腫瘤基因組研究協(xié)作組”(CCGC)，啟動了中國腫瘤基因組研究重大項目。初期，中國負責破譯胃癌的基因組序列，后又陸續(xù)對結(jié)直腸癌、食道癌、肝癌、鼻咽癌等14種腫瘤的驅(qū)動基因進行檢測，為實現(xiàn)個體化醫(yī)療奠定基礎。IGGC項目是TGCA完成后更大型的高通量測序應用。CCGC和ICGC研究工作將積極推動癌癥基因組學向腫瘤生物學的轉(zhuǎn)化研究，為腫瘤的個體化精準診療提供理論和技術支撐。ICGC數(shù)據(jù)匯總測序成本不斷下降成本快速下降，測序領域的超摩爾定律助推臨床應用

第一次人類基因組測序耗時13年，成本30億美元，到2008年11月，基因組測序僅需一兩周，花費10萬美元。到2015年，新一代儀器可將全基因組序列測序成本降到1000美元以下，成本不足第一代的百萬分之一。而且隨著技術進步，仍在不斷下降（100美元？）。WetterstrandKA.Availableat:

/sequencingcosts.

January15,2016摩爾定律戈登.摩爾（1965年,Intel）當價格不變時，集成電路上可容納的晶體管數(shù)目，約每隔18個月增加1倍，性能也提升1倍。即每一美元所能買到的電腦性能將每隔18個月提升1倍。這一定律揭示了信息技術進步的速度DNA測序數(shù)據(jù)庫的大小每18個月會增加10倍（NBB,2012）醫(yī)學革命---精準醫(yī)療精準醫(yī)學計劃的基礎大規(guī)模生物數(shù)據(jù)庫（如人類基因組序列、腫瘤基因組序列）有效闡述疾病的手段（基因組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學）分析數(shù)據(jù)的計算工具（生物信息學、大數(shù)據(jù)處理、云計算）精準腫瘤醫(yī)學模式RoychowdhuryS,ChinnaiyanAM.CACancerJClin.2016;66(1):75-88二、高通量測序與腫瘤個體化診治腫瘤臨床個體化診治應用生殖系基因組檢測腫瘤組織基因組檢測外周血游離DNA檢測腫瘤疾病易感性分析、相關藥物效果及毒副作用檢測將腫瘤診斷提前至病前預防層面腫瘤確證及腫瘤分子分型，輔助醫(yī)生確定最佳治療方案比起傳統(tǒng)癌癥組織病理切片耗時更短，更精確早期腫瘤相關篩查，腫瘤早期診斷和治療，預后與隨訪監(jiān)測術后連續(xù)監(jiān)測，避免癌組織取樣和癌細胞擴散風險臨床腫瘤高通量測序檢測分析策略RoychowdhuryS,ChinnaiyanAM.CACancerJClin.2016;66(1):75-88生殖系腫瘤突變檢測（Germline）臨床應用：檢測多種腫瘤的患病風險；腫瘤基因組合檢測檢測腫瘤基因型，判定家系成員患病風險指導腫瘤個性化治療（化療藥物選擇）針對腫瘤基因外顯子或SNP多態(tài)性位點NGS檢測RellingMV,

EvansWE.Nature.2015;526(7573):343-50兒童癌癥患者易感基因檢測ZhangJ,etal.NEnglJMed.2015,373(24):2336-46兒童和青少年癌癥的發(fā)病率和易感基因突變在很大程度上是未知的。關于這種突變的認識可提高對腫瘤發(fā)生的認識，指導患者治療，使患者和家庭能夠進行遺傳咨詢。對于是否存在胚系基因突變，研究人員分析了565個基因的DNA序列，其中包括60個與常染色體顯性遺傳性癌癥易感綜合征有關的基因。研究人員對1120例年齡小于20歲的腫瘤患者正常組織和腫瘤組織進行全基因組測序（595例）、全外顯子組測序（456例）或兩者都進行測序（69例）兒童癌癥患者易感基因檢測ZhangJ,etal.NEnglJMed.2015,373(24):2336-46結(jié)果發(fā)現(xiàn)95名兒童患者（8.5%）存在致病性或可能致病性基因突變。兒童癌癥患者攜帶成年癌癥的致病基因，如乳腺癌和卵巢癌（BRCA、PALB2）。這些基因是成年癌癥的主要驅(qū)動者，目前還不清楚它們是不是也能造成兒童癌癥。本研究表明在絕大部分兒童癌癥患者中家族史并不能預測出潛在的易感性綜合癥。高通量測序的胚系基因檢測未來將大有可為。AML新的基因組分類及預后新近研究發(fā)現(xiàn)了很多AML患者中的基因突變，但對于如何使用這些基因差異來解釋AML的病理生理機制并應用于臨床目前并不明確。本研究通過對參與臨床試驗的1540名AML患者分析了111個相關腫瘤基因，定義了新的AML亞組，及其與臨床預后的關系。作者在86%的AML患者中鑒定出76個基因的5234個drivermutation.依據(jù)基因組分析結(jié)果將AML組劃分成11個亞型，每一亞型具有獨特的診斷特征和臨床結(jié)局。是對2008WHO分型的改進。新的分型可以充分認識患者白血病的遺傳構(gòu)成，更好地對患者進行預后的預測，并利用這一信息來設計出一些新臨床試驗，為每種AML亞型開發(fā)出最好的療法。AML新的基因組分類及預后精準醫(yī)療在腫瘤治療中的作用本研究納入346個Ⅰ期臨床試驗研究，共13203名患者。比較使用個體化治療方案及非個體化治療方案兩組患者的responserate，progression-freesurvival。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用個體化治療方案相較于使用非個體化治療方案的腫瘤患者擁有更高的RR(30.6%v4.9%,P<0.0001)，更長的PFS(5.7v2.95月,P<0.001)。這些Ⅰ期臨床試驗研究的薈萃分析結(jié)果亦表明個體化治療方案能改善腫瘤患者的預后。個體化治療方案（即根據(jù)特定標志物檢測結(jié)果來選擇治療藥物）對于腫瘤患者是否能受益目前并不確定。SchwaederleM,etal.JClinOncol.2016(suppl;abstr11520)兒童腫瘤患者基因檢測項目的啟動英國將啟動兒童腫瘤患者的基因檢測項目，旨在未來兩年內(nèi)招募400名兒童，通過檢測分析81個腫瘤基因來為兒童腫瘤患者提供個體化治療并提高生存期兒童腫瘤患者較少，制藥公司無動力進行靶向藥物在此類患者中的臨床研究目前兒童腫瘤患者治療依靠化療和放療，有很大的副反應，如能針對性使用靶向藥物能很大程度上避免此類副反應，并提高患者生存期肺癌Lung結(jié)腸癌Colon黑色素瘤Melanoma胃癌Gastric卵巢癌OvarianEGFRKRASKRASBRAFBRAFKITKITPDGFRAAKT1PIK3CAAKT1PIK3CAGNAQKRASAKT1FGFR2AKT1ERBB2ALKPTENAPCPTENMAP2K1NRASPIK3CAp53PTENp53BRAFp53CTNNB1SRCPIK3CAPTENCTNNB1MAP2K1EGFRp53METNRASFBXW7METNRASIndustryGuidelinesEmergingandClinicalTrials腫瘤組織體細胞突變檢測（Somatic）指導腫瘤分子分型和個體化治療LawrenceMS,

StojanovP,

MermelCH,etc.Nature.2014,505(7484):495-501商品化泛腫瘤靶向高通量測序項目RoychowdhuryS,ChinnaiyanAM.CACancerJClin.2016;66(1):75-88基于組織的腫瘤體細胞突變檢測局限性很多腫瘤患者無法進行活檢或手術；穿刺受檢者嚴重不適感；穿刺自身的臨床風險；取材時間點受限，很難進行多次取樣；腫瘤異質(zhì)性；非侵襲性腫瘤檢測NICT

（Non-invasivecancertesting）非侵襲性腫瘤檢測（NICT）SpeicherMR,PantelK.Naturebiotechnology,2014;32(5):441-443循環(huán)腫瘤細胞(Circulatingtumorcells,CTCs)游離腫瘤DNA(CirculatingtumorDNA,ctDNA)液態(tài)活檢（LiquidBiopsy）循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）ctDNA：來自凋亡、壞死的腫瘤細胞或者腫瘤細胞的外泌體；主要以核小體的形式釋放入血；含量約占循環(huán)游離DNA的1%，甚至0.01%NGS可檢測ctDNA遺傳學改變DNA序列改變：點突變，缺失等CNV、染色體重排、非整倍體甲基化改變DiazLAJr,

BardelliA.JClinOncol.2014;32(6):579-86基于ctDNA的復發(fā)監(jiān)測與療效評估DiazLAJr,

BardelliA.JClinOncol.2014;32(6):579-86腫瘤來源血小板（Tumors‘‘educate’’platelets,TEPs）BestMG,SolN,KooiI.CancerCell.2015Nov9;28(5):666-76非侵襲性腫瘤檢測（NICT）結(jié)果顯示：基于TEPs的RNA測序能夠區(qū)分出228名是腫瘤患者（包括局部和轉(zhuǎn)移腫瘤）和55名是健康個體，其準確率達96%。也可以區(qū)分6種不同類型腫瘤，其準確率達71%?；赥EPs的RNA測序，使Her2陽性/KRAS基因突變/EGFR或PIK3CA陽性腫瘤得以準確區(qū)分。TEPs特征性mRNA表達譜為泛癌癥檢測、腫瘤分類和腫瘤突變基因診斷提供了一個有價值的平臺,并促進了基于血液非侵襲性液體活檢的發(fā)展。本研究從283名實驗對象身上抽取6mlEDTA抗凝血，分離血小板，提取血小板RNA，擴增RNA高通量測序后進行TEPsmRNA表達譜分析。cfDNA甲基化譜測序追溯變異來源KunSun,

etc.PNAS.2015;112:E5503-E5512外周血游離DNA檢測優(yōu)勢指導用藥均質(zhì)標本作為無法獲取組織標本的補充，無創(chuàng)取樣后的檢測結(jié)果指導臨床用藥實現(xiàn)實時動態(tài)監(jiān)測和預測腫瘤耐藥及復發(fā)情況，提高患者全程管理水平指導用藥實時監(jiān)測循環(huán)而勻質(zhì)的血液標本，在一定程度能有效克服檢測組織標本的異質(zhì)性均質(zhì)標本LebofskyR,DecraeneC,BernardV,etc.MolOncol.2015;9(4):783-90GoldB,CankovicM,FurtadoLV,etc.JMolDiagn.2015;17(3):209-24HeitzerE,UlzP,GeiglJB.ClinChem.2015;61(1):112-23ctDNA檢測面臨的問題腫瘤類型繁多，分子突變特點不一；高靈敏度定性、定量檢測，技術分辨率要求高；ctDNA來源復雜，不同腫瘤患者個體差異較大，數(shù)據(jù)解讀與注釋需謹慎；目前仍局限于晚期腫瘤的臨床應用；需要大規(guī)模、多中心臨床驗證數(shù)據(jù)。三、思考與挑戰(zhàn)思考與挑戰(zhàn)臨床檢測樣本的真實性20