郭勤 藥物分析論文

藥物分析論文題目：電泳技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用專業(yè)：生物技術(shù)學(xué)號：060552203 姓名:郭勤電泳技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用摘要:本文概述了電泳技術(shù)產(chǎn)生的背景以及發(fā)展歷程,簡要介紹了幾種常用的電泳技術(shù)的原理、特點(diǎn)以及在藥物分析中的應(yīng)用,尤其是高效毛細(xì)管電泳法在許多科學(xué)試驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用并取得了卓越的成效。關(guān)鍵詞電泳;電泳技術(shù);高效毛細(xì)管電泳電泳(electrophoresis)是指帶電質(zhì)點(diǎn)在電場作用下向異電荷電極移動。早在1808年俄國的物理學(xué)家Pence首先發(fā)現(xiàn)了電泳現(xiàn)象,1937年瑞典科學(xué)家Tiselius設(shè)計(jì)世界上第一臺電泳儀,建立了“移界電泳法(movingboundaryEP)”,用于研究蛋白質(zhì)的分離,開創(chuàng)了電泳技術(shù)的新紀(jì)元。而今電泳技術(shù)已成為國內(nèi)外生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)中不可缺少的分離分析手段之一,是生化藥物生產(chǎn)、分析中不可缺少的分析工具。尤其是高效毛細(xì)管電泳(HPCE)在分離分析酶、蛋白質(zhì)、多肽、核酸等大分子方面具有高分辨率、高靈敏度,分析時(shí)間短,用量少等特點(diǎn),是十分理想的分離手段。英國藥典從1975年版開始將電泳收載入附錄[1],1980版[2]、1988版[3]、1993版[4]將電泳方法增加到6種,1998年版又對自由移動界面電泳作了詳細(xì)說明[5]。美國藥典從1985版[6]起也開始將電泳收載入附錄,并對凝膠電泳的原理、影響因素作了詳細(xì)的說明,NF22冊又增加了DESK電泳[7]。中國藥典1990年版二部首次將電泳作為法定的、通用的檢測方法收載入附錄中[8]、1995年版[9]、2000年版[10]將電泳中的五種電泳技術(shù)(紙電泳法、醋酸纖維素薄膜電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法,聚丙烯酰胺凝膠電泳法、SDS2聚丙烯酰胺凝膠電泳法)在附錄中規(guī)定下來,并對高效毛細(xì)管電泳也作了詳細(xì)的說明?，F(xiàn)將目前常用的幾種電泳技術(shù)作簡要說明(具體裝置和操作方法中國藥典已作明確說明)。1紙電泳法(paperelectrophoresis)紙電泳法是20世紀(jì)50年代發(fā)展起來的一種電泳技術(shù),是用濾紙作為電泳支持介質(zhì)的一種方法。紙電泳法的設(shè)備簡單,應(yīng)用廣泛,是最早使用的一種電泳技術(shù)也是一種通用的分離、分析手段,在早期的生物化學(xué)研究中,紙電泳曾發(fā)揮重要作用,但由于紙電泳時(shí)間長,分辨率較差,近年來已逐漸為其他快速、簡便、分辨率高的電泳技術(shù)所代替。部頒標(biāo)準(zhǔn)1998年生化藥品第一分冊中僅有三磷酸腺苷二鈉、三磷酸腺苷二鈉注射液的含量的測定用的是紙電泳法[11],胞磷膽堿鈉有關(guān)物質(zhì)檢查也采用此法[12]。此外,其也在植物化學(xué)成份的分離中得以應(yīng)用,如糖類,三萜類等可利用其衍生物的方法使其分子帶電荷,再用紙電泳法進(jìn)行分離。2醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳法也是20世紀(jì)50年代發(fā)展起來的一種電泳技術(shù),是用醋酸纖維素薄膜作為電泳支持介質(zhì)的一種方法。具有以下優(yōu)點(diǎn):①電泳后區(qū)帶界限清晰,分辨力比紙電泳要強(qiáng)得多;②通電時(shí)間較短(20min～1h);③它對各種蛋白質(zhì)(包括血清白蛋白,溶菌酶及核糖核酸酶)都幾乎完全不吸附,因此無拖尾現(xiàn)象;④對染料也沒有吸附,因此不結(jié)合的染料能完全洗掉,無樣品處幾乎完全無色。它的電滲作用雖高但很均一,不影響樣品的分離效果,由于醋酸纖維素薄膜吸水量較低,因此必需在密閉的容器中進(jìn)行電泳,并使用較低壓電流避免蒸發(fā)。目前醋酸纖維素薄膜電泳已經(jīng)廣泛用于血清蛋白,血紅蛋白,球蛋白,脂蛋白,糖蛋白,甲胎蛋白,類固醇及同工酶等的分離分析以及免疫電泳等中,盡管它的分辨力比聚丙烯酰胺凝膠電泳低,但它具有簡單,快速等優(yōu)點(diǎn)。中國藥典1995年版人血白蛋白,人血丙種球蛋白、人胎盤蛋白、人胎盤血丙種球蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)純度測定采用的就是此法[13]。中國藥典2000年版二部中人乙型肝炎免疫球蛋白、人狂犬病免疫球蛋白、人破傷風(fēng)免疫球蛋白的鑒別就用免疫電泳法測定[14]。所以現(xiàn)在趨向用醋酸纖維薄膜電泳法代替紙電泳法。3聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)聚丙烯酰胺凝膠電泳是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一種電泳技術(shù),是根據(jù)被分離物質(zhì)所帶的電荷多少及其分子大小、形狀的不同,在電場的作用下,產(chǎn)生不同的移動速度而分離的方法。它具有電泳和分子篩的雙重作用。此法重復(fù)性高,凝膠柱彈性好,無電滲作用,且設(shè)備簡單,樣品量少,分辨率高,廣泛用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸,且能測定蛋白質(zhì)、酶和核酸的分子量。如血漿脂蛋白目前常用的一種含量測定方法用的就是聚丙烯酰胺凝膠電泳法。中國藥典2000年版二部中胰島素及中性胰島素注射液的有關(guān)蛋白質(zhì)檢查用的也是此法[15]。此外,8%聚丙烯酰胺凝膠電泳還用于性別基因鑒定。聚丙烯酰胺凝膠電泳法目前還廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞學(xué)、微生物學(xué)、植物學(xué)、動物學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科的研究以及臨床化驗(yàn)。4SDS2聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS2polyacrylamidegelelec2trophoresis)SDS2聚丙烯酰胺凝膠電泳法是20世紀(jì)60年代中期發(fā)展起來的一種電泳技術(shù),是聚丙烯酰胺凝膠電泳中的一種特殊分離技術(shù)。就是在電泳系統(tǒng)中加入一定濃度的十二烷基硫酸鈉(SDS)。目前,研究生命科學(xué)的工作都普遍用該法測定大分子的分子量。中國藥典1990、1995年版也收載此法,用于測定大分子生化藥品的分子量。中國藥典2000年版二部中尿激酶檢查分子組分比用的就是SDS2聚丙烯酰鈉凝膠電泳法,1998年部頒標(biāo)準(zhǔn)生化藥品第一分冊中L2門冬酰胺酶及注射用門冬酰胺酶的純度檢查也用此法[16]。此外SDS2聚丙烯酰胺凝膠電泳法還可用于測定胸腺肽的相對分子質(zhì)量[17]。5高效毛細(xì)管電泳法(highperformancecapiaryelectrophore2sis,HPCE)高效毛細(xì)管電泳法是近幾十年飛速發(fā)展起來的一項(xiàng)新的分析技術(shù)。它根據(jù)離子在緩沖液中遷移的速度與電場呈正比原理,將凝膠電泳解析度和快速液相色譜技術(shù)溶為一體,是繼高效液相色譜法出現(xiàn)后分析科學(xué)領(lǐng)域的又一次革命。其具有分離效率高(理論板數(shù)106～107/m)、快速(20～30min/次),用量少(鈉升級,對單細(xì)胞液進(jìn)行分離分析)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),可方便地連續(xù)洗脫樣品[18]。HPCE包括毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管凝膠電泳、膠束電動毛細(xì)管色譜、親和毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管電色譜、毛細(xì)管等電聚焦電泳和毛細(xì)管等速電泳。在藥物分析中最常用的技術(shù)是毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管凝膠電泳、膠束電動毛細(xì)管色譜,其它技術(shù)如毛細(xì)管等速電泳(CITP)等見有關(guān)專著[19]。HPCE在生物學(xué)中應(yīng)用十分廣泛,在蛋白質(zhì)、激素多肽、核酸等的鑒定、分離方面發(fā)揮了顯著作用。如Oto,Kuyper等[20]用HPCE對基因進(jìn)行了單鏈DNA構(gòu)象多態(tài)性分析,檢測到該基因的突變性,時(shí)間僅為幾十分鐘。這比用平板電泳所用的時(shí)間快得多且精確得多[21]。近期的研究表明,HPCE對單糖、多糖、脂類研究亦有遠(yuǎn)大前景,此外在臨床分析以及細(xì)菌、細(xì)菌代謝物測定方面的應(yīng)用日漸增多。高效毛細(xì)管電泳法由于分離效率高,速度快,樣品用量少,在化學(xué)、生命科學(xué)、藥物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)環(huán)境科學(xué)、農(nóng)學(xué)及食品科學(xué)等領(lǐng)域有著十分廣泛的應(yīng)用。從小無機(jī)離子到生物大分子,從荷電粒子到中性分子均能用高效毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行分離分析,尤其是對樣品珍貴,取樣量極少,機(jī)體復(fù)雜的生物大分子,高效毛細(xì)管電泳技術(shù)更展示出特有的分離能力與極大的應(yīng)用前景。如用于分析西維因等農(nóng)藥[22],用于藥物-蛋白質(zhì)結(jié)合研究[28],用于測定茶堿血漿濃度[29],用于測定中藥、中成藥的有效成分含量[30～32],用于分析水稻中的總核糖核酸[33]用于分析果蔬中VC含量[34],用于快速測定食品中的金屬硫蛋白[35]等。盡管還有許多技術(shù)問題有待進(jìn)一步解決,但其在藥物分析中的前景是引人注目的。參考文獻(xiàn):[1]TypesettingbytheBritishpharmacopoeiacommissionsecretariatusingAlduspagemakersoftware.BRITISHPHARMACOPOEIA,1974:96-7.[2]Typesettingbythebritishpharmacopoeiacommissionsecretariatusingal2duspagemaker.software.BRITISHPHARMACOPOEIA,1980:65-7.[3]Typesettingbythebritishpharmacopoeiacommissionsecretariatusingal2duspagemakersoftware[J].Britishpharmacopoeia,1988:86-9.[4]TypesettingbytheBritixhpharmacopoeiacommissionSecretariatusingalduspagemakersoftware[J].Britishpharmacopoeia,1993:103-106.[5]Typesettingbythebritishpharmacopoeiacommissionsecretariatusingal2dusPageMakersoftware.Brithishpharmacopoeia,1998:A131-A133.[6]Preparedbythecommitteeofrevisionandpublishedbytheboardoftrustees.Theunitedstatesxxi,1985:863-4.[7]Preparedbythexommitteeofrevisionandpublishedbytheboardoftrustees.Theunitedstatesxxi,1990:1583-5.[8]中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典,1990年版二部附錄,34-8.[9]中華人民共和國藥典委員會.中華人民共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