細胞免疫學技術(shù)

細胞免疫學技術(shù)2023/2/191第一頁，共三十二頁，2022年，8月28日細胞免疫學技術(shù)種類

細胞免疫學技術(shù)主要是對各種免疫細胞進行分離、鑒定、計數(shù)，并測定其功能。

細胞分離技術(shù)免疫細胞表面標志和功能的檢測

T細胞表面標志和功能的檢測

B細胞表面標志和功能的檢測

NK細胞活性的檢測吞噬細胞檢測技術(shù)2023/2/192第二頁，共三十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)免疫細胞的分離技術(shù)一、標本的采取與保存二、細胞分離技術(shù)三、分離標本的保存技術(shù)2023/2/193第三頁，共三十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)細胞的分離技術(shù)一、標本的采取與保存（一）血液標本的采取無菌采血，抗凝1、機械去纖維蛋白法（玻璃珠法）采血過程中，邊采邊搖采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滾動，以機械地除去纖維蛋白，使血液不能凝固。本法雖較麻煩，但本法簡便、對淋巴細胞的活性影響最小，且可減少血小板的混雜。2、肝素抗凝法

肝素能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，進而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白，防止血液凝固。3、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝法

EDTA為螯合劑，可與血液中鈣離子結(jié)合而抗凝。馬、牛、羊等大動物一般從頸靜脈采血，豬從頸靜脈、前腔靜脈或耳靜脈采血，家禽由翼下靜脈或心臟采血，兔由心臟或耳靜脈采血，犬由頸靜脈或四肢靜脈采血，豚鼠由心臟采血，小白鼠則可斷尾或剪斷腋下血管或剪斷眼球采血。馬、牛、羊等大動物一般從頸靜脈采血，豬從頸靜脈、前腔靜脈或耳靜脈采血，家禽由翼下靜脈或心臟采血，兔由心臟或耳靜脈采血，犬由頸靜脈或四肢靜脈采血，豚鼠由心臟采血，小白鼠則可斷尾或剪斷腋下血管或剪斷眼球采血。2023/2/194第四頁，共三十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)細胞的分離技術(shù)一、標本的采取與保存（二）胸腺細胞懸液的制備【方法】4周齡健康小鼠，體重14~16g。（1）小鼠頸椎脫臼處死。（2）迅速取出胸腺。置于100目鋼網(wǎng)上。注意無菌，洗干凈胸腺上的血管。（3）輕輕研磨，制成細胞懸液。（4）用臺盼藍染色，計數(shù)?；罴毎麛?shù)＞90%。看視頻2023/2/195第五頁，共三十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)細胞的分離技術(shù)一、標本的采取與保存（三）巨噬細胞的采取1、人巨噬細胞的收集（斑蝥酊敷貼法）2、小鼠腹腔巨噬細胞的制備【方法】20-25g小白鼠（1）小鼠頸椎脫臼處死（2）腹部消毒，無菌注入肝素-Hanks液（3）吸出腹腔液，洗滌，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度2023/2/196第六頁，共三十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)細胞的分離技術(shù)

二、細胞分離技術(shù)（一）外周血白細胞的分離

根據(jù)人外周血紅細胞與白細胞的比重不同，其沉降速度隨之而異。

1、自然沉降法利用RBC自然沉降率較快的分離法?？鼓谑覝鼗?7℃靜置30~60分鐘，血液即分成明顯的3層：上層為淡黃色血漿，緊貼紅細胞上面的灰白層為白細胞底層為紅細胞本法所得的白細胞損傷極輕微。2023/2/197第七頁，共三十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)細胞的分離技術(shù)一、標本的采取與保存（一）外周血白細胞的分離2、加速紅細胞沉降法

利用高分子量的聚合物（明膠）使紅細胞凝聚成串錢狀，借以加速紅細胞沉降，使之快速與白細胞分離。上層富含白細胞紅細胞凝聚成串錢狀沉積在底層，本法的細胞得率比自然沉降法高，但明膠增加白細胞粘性，對實驗有所影響。2023/2/198第八頁，共三十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)細胞的分離技術(shù)一、標本的采取與保存（二）外周血單個核細胞的分離（PBMC）[基本原理]根據(jù)人類各種血細胞的比重有所不同，利用一種比重介于1.075~1.092之間而接近等滲的分層液作密度梯度離心，使一定比重的細胞群按相應密度梯度分布，從而得以分離各種血細胞群。

表7人外周血細胞密度一覽表

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細胞密度（kg/m3）

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紅細胞＞1.092

粒細胞1.070~1.090

淋巴細胞和單核細胞1.060~1.075

血小板1.030~1.035—————————————————2023/2/199第九頁，共三十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)細胞的分離技術(shù)一、標本的采取與保存（三）淋巴細胞及其亞群的分離1、淋巴細胞的分離①玻器吸附法將分離的單個核細胞傾于無菌潔凈的玻璃平皿內(nèi)，置37℃30min～40min，用毛細吸管輕輕吸取懸液，即為淋巴細胞。用適量的Hank’s液沖洗平皿，收獲即為單核細胞懸液。②L-亮氨酸甲基酯法

單核-巨噬細胞內(nèi)富含溶酶體酶，它能攝取嗜溶酶體的L-亮氨酸甲基酯，集中于溶酶體上，使該酯轉(zhuǎn)化為對細胞本身有毒性的L-lencyl亮氨酸甲基酯，但不影響T、B、NK等細胞。用本法獲得的淋巴細胞純度大于99％，活力＞95％。2023/2/1910第十頁，共三十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)細胞的分離技術(shù)一、標本的采取與保存（三）淋巴細胞及其亞群的分離

2、淋巴細胞亞群的分離根據(jù)表面的標志不同，建立能選擇性純化所需細胞的技術(shù)。①E花環(huán)試驗分離T細胞群②尼龍毛分離方法分離T、B細胞③親和層析原理分離淋巴細胞亞群去除某一細胞群④熒光激活細胞分離儀（FACS）最佳分離方法磁性微球用于細胞的分離和純化（MACS技術(shù)）2023/2/1911第十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日免疫磁性微球的分離原理

直接法對細胞進行分類抗CD3磁球磁球結(jié)合T細胞加入B和T細胞中負向選擇正向選擇磁架進行分離間接法對T細胞進行分離單克隆抗體CD3羊抗鼠修飾磁球BiomagT細胞T細胞2023/2/1912第十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)細胞的分離技術(shù)三、分離標本的保存技術(shù)液氮深低溫（－196℃）保存技術(shù)

但降溫過程由于冰晶的形成和滲透壓的改變，可導致細胞的損傷和部分死亡。因此在冷凍過程要加冷凍保存劑，常用二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)。1、冷凍保存

將待凍細胞懸液加冷凍保存劑，并配成適當濃度，分裝小管。采用兩步降溫法，即及時迅速地將其降溫至一選擇好的臨界低溫作為過渡站，如一80℃低溫冰箱過夜，或放在液氮罐液面以上一層空間15~20h，然后再移放或沉入液氮中。2、復蘇

復蘇解凍必須迅速，力爭在20s內(nèi)使細胞完全融化。從液氮中取出后迅速移至40℃溫水中，融化后要充分洗滌重懸于新鮮培養(yǎng)液中，使細胞恢復活力。2023/2/1913第十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫細胞表面標志和功能的檢測

一、T細胞標志及功能的檢測

（一）T淋巴細胞受體的檢測1、E受體的檢測

（現(xiàn)多用于分離T細胞）2、白細胞介素-2受體的檢測

T細胞激活的特征

（多采用免疫組化學法）

2023/2/1914第十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫細胞表面標志和功能的檢測一、T細胞標志及功能的檢測（二）表面抗原的檢測

用單抗檢測T細胞表面抗原方法：標記抗體著染法抗體致敏花環(huán)法

1、間接免疫熒光法

淋巴細胞+抗相應CD的單抗→洗滌→再加熒光二抗→洗滌→取樣制片→熒光顯微鏡觀察計數(shù)l00~200個淋巴細胞，以熒光陽性細胞與計數(shù)細胞總數(shù)之比為相應CD抗原陽性的T細胞百分率。2023/2/1915第十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫細胞表面標志和功能的檢測一、T細胞標志及功能的檢測（二）表面抗原的檢測

2、抗體致敏細胞花環(huán)法

淋巴細胞懸液+抗CD抗體致敏的RBC懸液→置室溫片刻，經(jīng)低速離心→移放室溫1小時/4℃過夜后→重懸取樣涂片染色鏡檢共計100~200個淋巴細胞，以花環(huán)形成細胞數(shù)與計數(shù)細胞總數(shù)之比為相應CD抗原陽性細胞的百分率。2023/2/1916第十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫細胞表面標志和功能的檢測一、T細胞標志及功能的檢測（三）T細胞功能的檢測

1、T細胞增殖試驗（T細胞轉(zhuǎn)化試驗）判斷T細胞功能的一項非特異性體外免疫學檢測指標。[基本原理]在體外T細胞與刺激物共育后，細胞代謝和形態(tài)相繼會發(fā)生一系列的變化，在24~48h內(nèi)，蛋白質(zhì)和核酸合成增加，最終T細胞呈母細胞化，出現(xiàn)分裂增殖現(xiàn)象。有形態(tài)計數(shù)法和放射性核素計數(shù)法兩種2023/2/1917第十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫細胞表面標志和功能的檢測一、T細胞標志及功能的檢測（三）T細胞功能的檢測

2、T細胞介導的細胞毒（LMC）試驗評價機體細胞免疫水平的一種常用指標，腫瘤患者的判斷預后和觀察療效的指標之一。

（1）形態(tài)學檢查法

淋巴細胞+腫瘤細胞→混合共溫培養(yǎng)后→瑞氏染色→光鏡計數(shù)殘留的腫瘤細胞數(shù)，計算殺傷率。

本法不需特殊設(shè)備，操作較方便，但敏感性較差，不能確切反映細胞的損傷和死亡2023/2/1918第十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫細胞表面標志和功能的檢測一、T細胞標志及功能的檢測（三）T細胞功能的檢測

2、T細胞介導的細胞毒（LMC）試驗（2）放射性核素法一般采用125I-UdR摻入法或51Cr釋放法。

2023/2/1919第十九頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫細胞表面標志和功能的檢測二、B細胞標志及功能的檢測（一）受體的檢測

SmIg標志的檢測多采用間接熒光免疫法或酶免疫組織化學法（二）表面抗原的檢測用相應的CD系列單抗，用熒光免疫、酶免疫組織化學技術(shù)加以檢測CDl9、CD20、CD22、CD27等抗原2023/2/1920第二十頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫細胞表面標志和功能的檢測二、B細胞標志及功能的檢測（三）B細胞功能的檢測

1、血清中免疫球蛋白含量測定檢測方法：瓊脂單向擴散試驗，方法較粗糙；現(xiàn)用ICS儀作自動速率散射比濁法，迅速可靠。2023/2/1921第二十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日2023/2/1922第二十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫細胞表面標志和功能的檢測二、B細胞標志及功能的檢測（三）B細胞功能的檢測

2、細胞產(chǎn)生抗體能力的體外試驗檢測B細胞體外產(chǎn)生抗體的能力，不僅可以了解B細胞功能，還可研究B細胞分化增殖所需的條件，以及T細胞和巨噬細胞等與B細胞相互作用的調(diào)節(jié)機制。

2023/2/1923第二十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫細胞表面標志和功能的檢測二、B細胞標志及功能的檢測（三）B細胞功能的檢測

2、細胞產(chǎn)生抗體能力的體外試驗（1）溶血空斑技術(shù)又稱空斑形成細胞試驗[基本原理]用SRBC免疫動物不同天數(shù)后，取脾臟制成細胞懸液。將其與SRBC在半固體瓊脂凝膠內(nèi)混合，傾注于平皿或玻片上使成薄層，置37℃溫育?？贵w生成細胞可釋放抗SRBC抗體，后者與周圍SRBC結(jié)合使補體活化而產(chǎn)生溶血，在細胞周圍形成一個肉眼可見的透明溶血區(qū)，稱為溶血斑。每個空斑表示一個抗體生成細胞。2023/2/1924第二十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日2023/2/1925第二十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫細胞表面標志和功能的檢測三、NK細胞活性的檢測（一）NK細胞活性檢測的方法

1、形態(tài)學檢測法[基本原理]將效-靶細胞按一定比例混合共溫后，用臺盼藍、伊紅丫等（活細胞拒染）染料染色，分別計數(shù)著染的死細胞和不著染的活細胞，由此推算NK細胞的殺傷活性。用臺盼藍染色，須在3min內(nèi)完成計數(shù)，否則活細胞也將開始攝取染料而著染。伊紅丫染色在1~10min內(nèi)，死、活細胞比例不變。本法簡便易于掌握，但主觀因素較大，也無法計出遭輕微損傷的細胞。2023/2/1926第二十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫細胞表面標志和功能的檢測三、NK細胞活性的檢測（一）NK細胞活性檢測的方法

2、酶釋放檢測法[基本原理]將效-靶細胞共育一段時間后，根據(jù)靶細胞破壞后釋放的酶量推斷死亡的細胞數(shù)。通常以乳酸脫氫酶和堿性磷酸酶為檢測指標。取共育后離心的上清液，加酶底物顯色。根據(jù)光密度的變化確定酶含量的多少。[特點]經(jīng)濟、快速、簡便，可定量。[影響因素]有培養(yǎng)液、pH、溫度以及終止反應的時間等。實際操作時要嚴格掌握條件2023/2/1927第二十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫細胞表面標志和功能的檢測三、NK細胞活性的檢測（二）NK細胞活性檢測的臨床意義臨床的輔助診斷以及判斷預后，考核療效2023/2/1928第二十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫細胞表面標志和功能的檢測四、吞噬細胞檢測技術(shù)（一）中性粒細胞的檢測

中性粒細胞的檢測包括數(shù)量、細胞運動功能以及吞噬和殺菌功能的檢測。1、中性粒細胞吞噬和殺菌功能的檢測受檢細胞懸液內(nèi)按一定比例加入活的白色念珠菌懸液，混合保溫