菊花組織培養(yǎng)

菊花組織培養(yǎng)第一頁，共八十八頁，2022年，8月28日課題背景①植物細胞或組織，發(fā)育成完整植株，需要什么條件？②什么叫植物細胞的全能性？（1）概念：具有某種生物全部遺傳信息的任何一個細胞，具有發(fā)育成完整個體的潛能。

１.植物細胞全能性表現(xiàn)的條件：離體、適宜營養(yǎng)、一定比例的激素、無菌條件、適宜溫度、光照

當植物細胞，脫離了原來所在的植物體的器官或組織，而處于離體狀態(tài)時，在一定的營養(yǎng)物質、激素和其它外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整植株。２.植物細胞具有全能性思考（3）過程機理：在特定條件刺激下，在特定的時間和空間里，基因（遺傳信息）選擇性地表達出了特定的結構和功能蛋白。（2）原因：細胞內，含有某種生物全部遺傳信息第二頁，共八十八頁，2022年，8月28日基礎知識思考①植物細胞全能性的表現(xiàn)為什么一定需要離體條件？（一）植物組織培養(yǎng)的過程：１、細胞的分化（必修1－第117～118頁）（1）概念：在植物的個體發(fā)育過程中，由一個或一種細胞增殖的后代，在形態(tài)、結構、生理功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異的過程。

（3）機理：（2）過程：受精卵增殖、生長、分化形成組織、器官、系統(tǒng)基因在特定的時間和空間里，選擇性地表達出了特定結構和功能的蛋白質?；虮磉_的程序，在個體發(fā)育的很早時期，就已經預定下來，由于機體各部位間分工協(xié)作的需要，原預定程序是不可更改的。所以，在生物體內，已經分化的細胞是不可能表現(xiàn)出全能性的。即在個體發(fā)育的不同時期，生物體不同部位的細胞表達的基因不同，合成了不一樣的蛋白質。第三頁，共八十八頁，2022年，8月28日（4）細胞分化的特點：①持久性：細胞分化是一種持久性的變化，一般來說，分化了的細胞將一直保持分化后的狀態(tài)，直到死亡。②普遍性：由于不同生物細胞分化的機理是大致相同的，所以細胞分化現(xiàn)象，在具細胞結構的生物體內是一種普遍存在的生理現(xiàn)象。③重要性：多細胞植物體的細胞分化，是建立在有絲分裂基礎上的，如果只有細胞分裂，細胞彼此一樣，生物體的各部分之間，就不能進行分工協(xié)作了。正是有了細胞分化，才使多細胞生物體中的細胞趨向專門化，才能提高了機體各種生理功能的效率。③全能性：多細胞植物內已分化細胞，盡管形態(tài)、結構和功能各異，但它們都由一個細胞（如受精卵）有絲分裂來的，細胞內仍保留著某種生物的全部遺傳信息，仍具有發(fā)育成完整新個體的潛能。第四頁，共八十八頁，2022年，8月28日2、植物組織培養(yǎng)的基本過程離體條件下，盡管有改變細胞內原來預定的基因選擇性表達程序的可能，但要讓離體細胞發(fā)育成完整的植株，并不容易。離體的植物組織或細胞外植體有絲分裂脫分化愈傷組織長出叢芽生根移栽成活長成植株再分化（1）組織培養(yǎng)程序第五頁，共八十八頁，2022年，8月28日（2）相關概念①外植體：從活植物體上切下，用于進行離體培養(yǎng)的植物器官或組織片段。②愈傷組織:細胞排列疏松而無規(guī)則,是高度液泡化的、呈無定形狀態(tài)的薄壁細胞③脫分化：脫分化產生的愈傷組織繼續(xù)進行培養(yǎng)，又可以重新分化成根或芽等器官，這個過程叫再分化。由高度分化的植物組織或細胞，產生愈傷組織的過程。④再分化：啟動脫分化、再分化，往往需要使用植物激素，人為地進行控制；其中細胞分裂素、生長素是關鍵激素。第六頁，共八十八頁，2022年，8月28日（二）影響植物組織培養(yǎng)的因素：1.植物材料的選擇（1）不同的植物組織，培養(yǎng)的難易程度差別很大煙草和胡蘿卜的組織培養(yǎng)較為容易枸杞愈傷組織的芽誘導比較難（2）同一植物材料的年齡、保存時間的長短會影響實驗結果菊花的組織培養(yǎng)，一般選擇未開花植株的莖上部，新萌生的側枝。（內因）2.不同的離體組織和細胞對營養(yǎng)、環(huán)境等條件的要求相對特殊，需配置不同的培養(yǎng)基（外因）第七頁，共八十八頁，2022年，8月28日MS培養(yǎng)基配方（P84頁，附錄3－八）第八頁，共八十八頁，2022年，8月28日A、大量元素:N、P、S、K、Ca、Mg等B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Co、I、Mo等C、有機物、植物激素MS培養(yǎng)基主要成分包括：①你能說出各種營養(yǎng)物質的作用嗎？②同專題2中微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？思考微量、大量元素：提供植物細胞生活所必需的無機鹽；蔗糖：提供碳源，同時能夠維持細胞的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質：主要是為了滿足離體植物細胞對特殊營養(yǎng)的需求。微生物培養(yǎng)基，以有機營養(yǎng)為主。MS培養(yǎng)基，則需提供大量無機營養(yǎng)。第九頁，共八十八頁，2022年，8月28日（1）常用的植物激素：生長素、細胞分裂素和赤霉素①生長素類：2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）吲哚乙酸（IAA）

萘乙酸（NAA）吲哚丁酸（IBA）②細胞分裂素類：激動素（KT）6－芐基嘌呤（6－BA）玉米素（ZT）③赤霉素類：赤霉酸（GA3）3、植物激素的影響第十頁，共八十八頁，2022年，8月28日（2）生長素和細胞分裂素作用植物中生長素和細胞分裂素，是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關鍵性激素。在生長素存在的情況下，細胞分裂素的作用呈現(xiàn)加強的趨勢。使用順序實驗結果同時使用先使用細胞分裂素后使用生長素先使用生長素，后使用細胞分裂素有利于細胞分裂，但不利分化細胞既分裂也分化分化頻率提高第十一頁，共八十八頁，2022年，8月28日生長素細胞分裂素>有利于根的分化生長素細胞分裂素<有利于芽的分化抑制根的分化生長素細胞分裂素＝促進愈傷組織生長（3）生長素和細胞分裂素同時使用，用量的比例對植物細胞發(fā)育方向的影響（4）pH、溫度、光照進行菊花組織培養(yǎng)時：不同植物，對各種條件的要求往往不同。pH控制在5.8左右，溫度控制在18－22OC.每日用日光燈照射12h。第十二頁，共八十八頁，2022年，8月28日菊花組織培養(yǎng)的實驗操作程序（一）制備MS固體培養(yǎng)基（二）外植體消毒（三）接種（四）培養(yǎng)（五）移栽（六）栽培第十三頁，共八十八頁，2022年，8月28日實驗操作（一）制備MS固體培養(yǎng)基配制母液→配制MS固體培養(yǎng)基→高壓蒸汽滅菌1.配制各種母液

大量元素：濃縮10倍；微量元素：濃縮100倍；二者均常溫保存激素、維生素類用量少的有機物按1mg/mL配成母液（1）一般要求

（2）配制母液的意義：①減少工作量；②減少微量試劑稱量所造成的誤差

第十四頁，共八十八頁，2022年，8月28日（3）配制母液流程：稱量→溶解→混合→定容→標記→保存（4OC）（2）配制母液的意義：①減少工作量；②減少微量試劑稱量所造成的誤差微量級分析天平微量元素大量元素有機物鐵鹽第十五頁，共八十八頁，2022年，8月28日2.配制培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌

依次加入大量元素、微量元素、有機物、激素母液根據(jù)各種母液的濃縮倍數(shù)，計算用量將稱好的瓊脂加入800mL蒸餾水，加熱，熔化瓊脂加入30g蔗糖，攪拌均勻加蒸餾水定容到1000mL調節(jié)pH

分裝到錐形瓶中（每瓶50mL～100mL）高壓蒸汽滅菌(培養(yǎng)基+其他器械)立式高壓滅菌鍋第十六頁，共八十八頁，2022年，8月28日1.選材：（二）外植體消毒2.消毒①流水沖洗菊花莖段用流水沖洗后可加少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右②酒精處理用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分數(shù)為70％的酒精中搖動2～3次，持續(xù)6～7s，立即將外植體取出，在無菌水中清洗

③消毒液處理取出后用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入質量分數(shù)為0.1％的氯化汞溶液中1～2min，取出后在無菌水中至少清洗3次，漂凈消毒液。取菊花未開花植株，莖上部生長旺盛的嫩枝

要兼顧藥劑的消毒效果和外植體的耐受力幼葉、幼莖（枝）、花瓣、嫩芽等生長旺盛的幼嫩組織

花藥（花粉）第十七頁，共八十八頁，2022年，8月28日進行消毒外植體消毒液要完全浸沒外植體消毒液：70%酒精、0.1%HgCl、

10%次氯酸鈉消毒時間依據(jù)材料而定外植體第十八頁，共八十八頁，2022年，8月28日（三）接種1.接種前準備

污染的主要來源是空氣中的細菌和孢子，接種環(huán)境的消毒是至關重要的。如果條件允許，接種外植體，要在超凈工作臺中進行，確保無菌操作。

接種前一天，用70％的酒精噴霧消毒空氣，

用酒精或新潔爾滅擦試工作臺，并用紫外線照射20分鐘。①接種室，超凈工作臺的消毒②接種前，啟動超凈工作臺，如打開吹風和照明燈開關等等。第十九頁，共八十八頁，2022年，8月28日③做好接種準備工作在等待外植體消毒的同時，做好接種準備工作：用酒精進行桌面消毒。用酒精棉球對培養(yǎng)基和培養(yǎng)基瓶口進行消毒。準備無菌紙點燃酒精燈第二十頁，共八十八頁，2022年，8月28日2.接種時的無菌操作要求接種操作要在酒精燈火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌，接種后立即蓋好瓶蓋。灼燒接種工具時，要注意安全第二十一頁，共八十八頁，2022年，8月28日①將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶整齊地排列在酒精燈左側。②將消過毒的菊花莖段，在無菌培養(yǎng)皿中切成小段（長約0.5～1cm）。③左手持錐形瓶，右手拉開捆扎錐形瓶的繩子，并將封口膜攥于右手心，以避免封口膜接觸瓶口的一面被污染。④左手持錐形瓶，瓶口旋轉通過火焰；右手用鑷子夾取菊花莖段插入培養(yǎng)基中（不要倒插）⑤接種后，將封口膜重新扎好⑥瓶外壁貼上標簽：植物名稱、接種日期、姓名等3.接種過程第二十二頁，共八十八頁，2022年，8月28日接種后，在酒精燈火焰上轉動灼燒瓶口，加蓋貼標簽：植物名稱接種日期姓名等第二十三頁，共八十八頁，2022年，8月28日【接種注意事項】①每接種一塊外植體前，鑷子需放入體積分數(shù)為70％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精燈火焰上燒一遍，冷卻后再接種②外植體在培養(yǎng)基中要分布均勻，放置外植體數(shù)量根據(jù)錐形瓶的大小確定，一般胡蘿卜3－4塊，菊的莖或葉6－8塊，也不要太少，以充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和光照條件③插入時應注意方向，不要倒插。莖段、莖尖基部插入培養(yǎng)基，利于吸收水分和養(yǎng)分第二十四頁，共八十八頁，2022年，8月28日（四）培養(yǎng)

接種后的錐形瓶最好放在無菌箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)期間應定期消毒。培養(yǎng)溫度控制在18～200C，并且每日用日光燈光照12h.1、愈傷組織的培養(yǎng)2周后，培養(yǎng)基成分接近耗盡，必須更換培養(yǎng)基，進行繼代培養(yǎng)（即分瓶擴大培養(yǎng)）.從接種外植體到出現(xiàn)愈傷組織需經過2周時間。2周之內可以看到，外植體上逐漸長出乳白色或黃白色的瘤狀愈傷組織。首次培養(yǎng)愈傷組織時，恒溫箱的門應該關閉不必見光，因為在無光條件下愈傷組織長的更快。第二十五頁，共八十八頁，2022年，8月28日愈傷組織開始分化愈傷組織培養(yǎng)室里培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)第二十六頁，共八十八頁，2022年，8月28日2.愈傷組織的繼代培養(yǎng)（切割、分瓶擴大培養(yǎng)）

繼代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)愈傷組織的相同，在嚴格的無菌條件下，將愈傷組織連同原來的外植體一起移到新培養(yǎng)基上，進行繼代培養(yǎng)。

繼代培養(yǎng)一代為20d。若時間過長，因培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質減少，外植體會分泌有毒物質，造成自身中毒。

如果愈傷組織長到直徑為1～1.5cm時，就可以進行試管苗培養(yǎng)，否則還需進行第二代繼代培養(yǎng).

繼代培養(yǎng)期間恒溫箱的門要打開，讓愈傷組織見光，見光后，愈傷組織顏色逐漸轉為綠色3.試管苗的培養(yǎng)愈傷組織長到直徑為1～1.5cm時，更換培養(yǎng)基，進行試管苗的見光培養(yǎng).第二十七頁，共八十八頁，2022年，8月28日切割、分瓶擴大繁殖第二十八頁，共八十八頁，2022年，8月28日無菌室里超凈工作臺上的切割過程第二十九頁，共八十八頁，2022年，8月28日（五）移栽（練苗、移栽、栽培）在移栽生根的菊花試管苗之前，應先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日.1.打開封口膜：2.清洗轉移：用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時間3.移栽：幼苗長壯后，移栽到土壤中珍珠巖：是一種火山噴發(fā)的酸性熔巖，經急劇冷卻而成的玻璃質巖石，有弧形或圓形裂隙，如珍珠的結構，所以被命名為珍珠巖。是一種天然、無毒，在高溫作用下會膨脹比較少見的礦物質。屬于硅酸鹽。

蛭石：特點：固體基質，含水量高、蓄水性強、透性好，適合栽培練苗移栽栽培第三十頁，共八十八頁，2022年，8月28日六、煉苗、移栽移植到消過毒的蛭石或珍珠巖上的幼苗長在蛭石和珍珠巖上的幼苗第三十一頁，共八十八頁，2022年，8月28日（六）栽培

幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花第三十二頁，共八十八頁，2022年，8月28日1、培養(yǎng)基的滅菌（高壓蒸汽滅菌）2、外植體的消毒（酒精、氯化汞）3、接種的無菌操作（酒精、酒精燈——灼燒）4、無菌箱中的培養(yǎng)；5、移栽到消過毒的環(huán)境中生存一段時間。在整個操作過程中，是如何來實現(xiàn)無菌環(huán)境的？第三十三頁，共八十八頁，2022年，8月28日你打算做幾組重復？你打算設置對照實驗嗎？設置對照實驗，可以取用一個經過滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說明培養(yǎng)基制作合格，沒有被雜菌污染。答：每種材料或配方至少要做一組以上的重復。思考第三十四頁，共八十八頁，2022年，8月28日2.外植體的生理狀態(tài)是成功進行組織培養(yǎng)的重要條件之一。生長旺盛的嫩枝生理狀況好，容易誘導脫分化和再分化。練習第36頁－練習題11.植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料，體積小、抗性差，對培養(yǎng)條件的要求較高。用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，同樣適合于某些微生物的生長，如一些細菌、真菌等的生長。而培養(yǎng)物一旦受到微生物的污染，就會導致實驗前功盡棄，因此要進行嚴格的無菌操作。第36頁－練習題2第三十五頁，共八十八頁，2022年，8月28日(1)培育無病毒植株4、植物組織培養(yǎng)的應用：(2)實現(xiàn)優(yōu)良品種的快速繁殖，保持遺傳性狀的一致(3)實現(xiàn)花卉的連續(xù)生產，不受季節(jié)的限制因為，植物的根尖，芽尖的分生組織，由于細胞分裂、增殖快，常常沒有病毒；以此為外植體，通過組織培養(yǎng)繁殖而的植株，一般沒有病毒。因為，花卉組織培養(yǎng)是在實驗室中進行，條件是可控的。第三十六頁，共八十八頁，2022年，8月28日(4)培養(yǎng)紫草愈傷組織,提取紫草素（治療燙傷和割傷的藥物以及染料和化妝品的原料）(6)基因工程中亦需用到植物組織培養(yǎng)的方法(5)誘導離體的植物組織形成具有生根發(fā)芽能力的胚狀結構，包裹上人造種皮，制成人工種子，可以解決有些作物品種繁殖能力差，結子困難或發(fā)芽率低等問題.第三十七頁，共八十八頁，2022年，8月28日三、課題延伸1、一般來說，容易進行無性繁殖的植物，也容易進行組織培養(yǎng)2、實例：蘆薈、豆瓣綠、秋海棠、月季第三十八頁，共八十八頁，2022年，8月28日此時的組織或細胞為離體的，即細胞所生活的環(huán)境為液體有機物營養(yǎng)環(huán)境，而不是能體現(xiàn)其整個植物體的光能自養(yǎng)在培養(yǎng)過程中，是脫分化、再分化的過程，隨著芽和根的形成，就具有了自養(yǎng)的能力，是由細胞到一個個體的演變過程1、高等植物是光能自養(yǎng)型生物，為什么在植物組織培養(yǎng)過程中還需要提供有機物培養(yǎng)基？2、培養(yǎng)過程中為什么需要進行光照思考？第三十九頁，共八十八頁，2022年，8月28日1、外植體帶菌2、培養(yǎng)基及接種器具滅菌不徹底3、接種操作時帶入4、環(huán)境不清潔結合錄像外植體滅菌與接種操作，談談組織培養(yǎng)污染的主要途徑及怎樣預防污染？第四十頁，共八十八頁，2022年，8月28日第四十一頁，共八十八頁，2022年，8月28日菊花的組織培養(yǎng)JLSSYBYH第四十二頁，共八十八頁，2022年，8月28日第四十三頁，共八十八頁，2022年，8月28日第四十四頁，共八十八頁，2022年，8月28日

菊花是菊科菊屬的多年生宿根草本植物,是我國的傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一長期以來菊花采用分株、扦插等無性繁殖方法進行繁殖但是傳統(tǒng)的繁殖方法易受環(huán)境影響,繁殖周期長,隨著市場需求的急劇增加,已經不能滿足市場日益發(fā)展的需要。植物組織培養(yǎng)具有增殖效率高、繁殖速度快的特點,可以用較短的時間和較少的空間生產出大量的試管苗第四十五頁，共八十八頁，2022年，8月28日扦插嫁接壓條

第四十六頁，共八十八頁，2022年，8月28日（四）培養(yǎng)1、愈傷組織的培養(yǎng)從接種外植體到出現(xiàn)愈傷組織需經過2周時間。2周之內可以看到外植體上逐漸長出乳白色或黃白色的瘤狀愈傷組織。首次培養(yǎng)愈傷組織時，恒溫箱的門應該關閉不必見光，因為在無光條件下愈傷組織長的更快。2周后，培養(yǎng)基成分接近耗盡，必須更換培養(yǎng)基，進行繼代培養(yǎng)第四十七頁，共八十八頁，2022年，8月28日繼代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)愈傷組織的相同，在嚴格的無菌條件下，將愈傷組織連同原來的外植體一起移到新培養(yǎng)基上。愈傷組織的繼代培養(yǎng)一代為20d。如果延長時間，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質減少，外植體會分泌有毒物質，造成自身中毒。如果愈傷組織長到直徑為1－1.5cm時，就可以進行試管苗培養(yǎng)，否則還需進行第二代繼代培養(yǎng)2、愈傷組織的繼代培養(yǎng)在愈傷組織繼代培養(yǎng)期間，將恒溫箱的門打開，讓愈傷組織見光，愈傷組織見光后顏色可以轉為綠色第四十八頁，共八十八頁，2022年，8月28日3、試管苗的培養(yǎng)當愈傷組織長到一定大小后，可以更換培養(yǎng)基，進行試管苗的見光培養(yǎng)（五）移栽移栽生根的菊花試管苗之前，應先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日1、打開封口膜2、清洗轉移用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時間第四十九頁，共八十八頁，2022年，8月28日同常規(guī)的無性繁殖方法相比，組織培養(yǎng)快速繁殖法主要具有以下優(yōu)點：（1）快速。采用常規(guī)的方法如分株法，一棵花卉一年一般只能生產幾株或幾十株，但用組織培養(yǎng)的方法則每年可以繁殖出幾萬甚至數(shù)百萬的小植株。（2）周年生產。花卉組織培養(yǎng)快速繁殖是在實驗室中進行，因條件可控，所以不受季節(jié)限制，可以全年進行連續(xù)生產。而常規(guī)的無性繁殖則受季節(jié)限制，只能在花卉生長季節(jié)進行繁殖。（3）經濟效益高。花卉組織培養(yǎng)快速繁殖所需要的空間小，在一個200平方米的培養(yǎng)室內一年可生產試管苗上百萬株。如按每株1元計算，每年產值上百萬元。（4）以組織培養(yǎng)繁殖的種苗與母株有著相同的遺傳基因。所以使用這項技術可讓優(yōu)良的品種不斷地延續(xù)。組織培養(yǎng)與常規(guī)繁殖相比優(yōu)點眾多第五十頁，共八十八頁，2022年，8月28日植物組織培養(yǎng)過程示意圖2、上面的示意圖中還有什么地方不夠完善的？沒有進行滅菌處理，試管也沒有做密封等。第五十一頁，共八十八頁，2022年，8月28日專題3課題1菊花的組織培養(yǎng)第五十二頁，共八十八頁，2022年，8月28日試評價下列操作正確與否第五十三頁，共八十八頁，2022年，8月28日第五十四頁，共八十八頁，2022年，8月28日本課題內容小結菊花組織培養(yǎng)基礎知識實驗操作植物體的組織培養(yǎng)影響組織培養(yǎng)的因素細胞分化細胞全能性組織培養(yǎng)過程營養(yǎng)激素環(huán)境條件MS固體培養(yǎng)基制備外植體消毒接種培養(yǎng)移栽栽培第五十五頁，共八十八頁，2022年，8月28日作業(yè)：P36

1、在植物組織培養(yǎng)過程中，為什么要進行一系列的消毒、滅菌，并且要求無菌操作。2、在選取菊花莖段是，為什么要選取生長旺盛的嫩枝？第五十六頁，共八十八頁，2022年，8月28日第五十七頁，共八十八頁，2022年，8月28日第五十八頁，共八十八頁，2022年，8月28日三、接種外植體1.前期準備啟動超凈工作臺（打開吹風和照明燈開關）第五十九頁，共八十八頁，2022年，8月28日在等待外植體消毒的同時，做后面的準備工作—如點燃酒精燈、用酒精棉進行培養(yǎng)基和培養(yǎng)基瓶口的消毒、桌面的酒精消毒、準備無菌紙等。第六十頁，共八十八頁，2022年，8月28日倒掉消毒液用無菌水反復沖洗多次第六十一頁，共八十八頁，2022年，8月28日灼燒接種工具，注意安全2.在酒精燈旁操作進行外植體切割和接種第六十二頁，共八十八頁，2022年，8月28日在無菌紙上切割外植體第六十三頁，共八十八頁，2022年