原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化

原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化第一頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo培養(yǎng)基成分高滲溶液（有機(jī)/無機(jī)）緩沖液的pH（5.8-7.4）酶解條件（時(shí)間/各種酶的比例）酶液用高鹽還是高滲緩沖液配擦鏡紙收集菌絲體or離心收集菌絲體雙層or單層培養(yǎng)基第二頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》周德慶（酵母）1、接種于液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、取培養(yǎng)液10ml，4000r/min離心5min,棄上清液，用Tris-HCl(pH7.4)、0.5mol/LEDTA、高滲緩沖液各洗滌一次。3、用含10mmol/L巰基乙醇的高滲緩沖液稀釋裂解酶液。4、加酶液，100r/min搖床50-100min酶解。脫壁效果達(dá)70%左右即停止酶解。5、100r/min離心三分鐘，去沉淀，取上清。再2000r/min離心10min收集沉淀原生質(zhì)體。6、高滲緩沖液洗滌2次，2000r/min離心10min收集原生質(zhì)體，最終用1ml高滲緩沖液懸浮原生質(zhì)體。高滲緩沖液：蔗糖0.5mol/L,MgCl210mmol/L,Tris-HCl(pH7.4)10mmol/L第三頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo1、原生質(zhì)體混合、PEG助融2、雙層平板：底層10ml的固體培養(yǎng)基（1.2%瓊脂），將樣品加入5ml融化后的半固體培養(yǎng)基（0.6%瓊脂，預(yù)保溫42℃）中，快速混合，導(dǎo)入鋪有底層培養(yǎng)基的平板上。待上層凝固后，置于恒溫箱培養(yǎng)第四頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo《工業(yè)微生物育種學(xué)》施巧琴吳松剛*菌絲培養(yǎng)基：1、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基2、PDA培養(yǎng)基（一種普遍用于酵母菌和霉菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，被推薦用于各類食品和飲料中酵母菌和霉菌檢測(cè)和計(jì)數(shù)）3、査氏培養(yǎng)基（用于真菌的分離鑒定，霉菌、白色念珠菌、酵母等微生物）*再生培養(yǎng)基：同查氏培養(yǎng)基，其中含NaCl濃度為0.8mol/L第五頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo*緩沖液：磷酸氫二鈉-檸檬酸溶液*高滲溶液：0.6mol/LNaCl溶液*酶溶液：蝸牛酶、纖維素酶，用0.7mol/L的NaCl配制，G6砂芯漏斗抽濾除菌第六頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo取107個(gè)/mL的單孢子懸浮液，涂布于平板表面的玻璃紙上，培養(yǎng)后用無菌鑷子將培養(yǎng)菌絲體的玻璃紙轉(zhuǎn)移并倒復(fù)在已配好的酶液內(nèi)，輕輕抖動(dòng)玻璃紙，菌絲體散落在酶液中，然后去玻璃紙，酶解，定時(shí)取樣觀察。（該法收集的菌絲體會(huì)十分干凈，免去了洗滌、離心等手續(xù)，減少對(duì)菌絲的傷害和雜菌污染）酶解1-2h，將培養(yǎng)皿內(nèi)破碎菌絲體和原生質(zhì)體混合液用吸管吹吸數(shù)次，用G2或G3砂芯漏斗過濾，使原生質(zhì)體同菌絲體碎片分開，濾液1500-2000r/min離心10min，洗滌去上清，懸浮于同一高滲溶液中。再將含有原生質(zhì)體的濾液用再生培養(yǎng)基洗滌三次，以清除酶液，然后用保存液懸浮。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，冷藏備用。雙層平板，再生，計(jì)算原生質(zhì)體再生率。第七頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo林艷學(xué)姐：挑AspergillusoryzaeP5菌絲于葡萄糖-蛋白胨斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)6~7天，至孢子成黃綠色取新鮮培養(yǎng)的斜面7支，用20mL無菌水洗下成熟孢子于鋪滿玻璃珠的三角瓶中，置搖床上150r/min振蕩分散30min經(jīng)四層無菌鏡頭紙過濾，制成孢子濃度約為107個(gè)/mL的單孢子懸浮液將上述制得的孢子懸浮液每1mL接種于一瓶盛有50mL菌絲培養(yǎng)基的三角瓶中，于30℃靜止培養(yǎng)23~25h6000r/min，離心10min收集幼嫩的菌絲體用無菌水洗滌菌絲體，4000r/min，離心5min收集菌絲體用PBA溶液洗滌菌絲體兩次，每次4000r/min，離心5min收集菌絲體第八頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo以0.15g濕菌體用酶量1mL的比例，加入酶液，置于滅菌平板中置33℃搖床上80r/min振蕩酶解，每半小時(shí)取樣，在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的釋放情況待酶解完全后，加等體積1mol/L山梨醇溶液，用四層無菌鏡頭紙過濾，除去未酶解的菌絲體殘片，收集原生質(zhì)體液4000r/min室溫離心10min，收集原生質(zhì)體沉淀去上清，沉淀用1mol/L山梨醇溶液洗滌2次，每次4000r/min離心10min棄上清將原生質(zhì)體懸浮于5mL1mol/L山梨醇溶液中，-70℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆玫诰彭?，共二十一頁?022年，8月28日CompanyLogo將制備好的原生質(zhì)體溶液3200r/min，4℃離心10min；棄上清，沉淀重懸于預(yù)冷的STC溶液中，將原生質(zhì)體濃度調(diào)整為5×106~5×107個(gè)細(xì)胞/mL；將約2~5μg質(zhì)粒DNA(體積不超過10μL)與100μL米曲霉原生質(zhì)體置冰上輕輕混勻；加入25μLPTC溶液，冰浴20min；加入1mLPTC溶液，室溫放置15min；最后加入2mLSTC溶液，混勻。將適量上述轉(zhuǎn)化液涂布于高滲再生基本培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5~7天，所長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化成功的菌株；同時(shí)設(shè)置未加質(zhì)粒而轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體涂布平板作為陰性對(duì)照。第十頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo菌絲培養(yǎng)基葡萄糖含量為0.5%的葡萄糖-蛋白胨完全培養(yǎng)基。高滲再生培養(yǎng)基以1.2mol/LSorbitol（山梨糖醇）配制的葡萄糖-蛋白胨基本固體培養(yǎng)基。0.2mol/L磷酸緩沖液（pH6.0）：0.2mol/LNaH2PO4·2H2O（約240mL）和0.2mol/LNa2HPO4·12H2O（約60mL）混合至pH為6.0第十一頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo混合酶液：2%纖維素酶，1%蝸牛酶，5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）用pH6.0的含0.4mol/LNH4Cl的0.2mol/L磷酸緩沖液配置混合酶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾除菌，保存于4℃PTC溶液：25%PEG8000，50mmol/LCaCl2，10mmol/LTris-HCl(pH7.5)STC溶液：1.2mol/LSorbitol，50mmol/LCaCl2，10mmol/LTris-HCl(pH7.5)第十二頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo1.米曲霉C-2在2%G-P斜面培養(yǎng)6天至長(zhǎng)出孢子，滅菌去離子水洗下孢子，經(jīng)四層擦鏡紙過濾制成孢子懸液，接種于50mL0.5%G-P菌絲全培養(yǎng)基，30℃靜置培養(yǎng)23~25h；2.過濾收集菌體，用無菌水與0.8MNaCl各洗滌一次；3.菌體置于滅菌培養(yǎng)皿中，加入15ml酶解液（2%纖維素酶、1%蝸牛酶、3mMDTT）；4.置30℃搖床（80r/min）酶解3h左右，在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的釋放情況；5.酶解完全后，四層擦鏡紙過濾，除去未酶解菌絲，離心收集原生質(zhì)體；6.用0.8MNaCl洗滌二次，0.8MNaCl-50mMCaCl2

洗滌一次；7.棄上清原生質(zhì)體重懸于100μL0.8MNaCl-50mMCaCl2中，血球板計(jì)數(shù)。王金良學(xué)長(zhǎng)：第十三頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo1、將構(gòu)建的pMD-pyrG質(zhì)粒與100μL原生質(zhì)體置冰上輕輕混勻；加入25μL預(yù)冷PTC，冰浴30min；2、再加入500μL上述PTC溶液，平靜混勻，室溫20min；加入預(yù)冷1mL0.8MNaCl-50mMCaCl2，混勻；3、與100mL米曲霉高滲再生培養(yǎng)基混合，倒平板；30℃培養(yǎng)4-7天。第十四頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo培養(yǎng)基成分高滲溶液（有機(jī)/無機(jī)）緩沖液的pH（5.8-7.4）酶解條件（時(shí)間/各種酶的比例）酶液用高鹽還是高滲緩沖液配擦鏡紙收集菌絲體or離心收集菌絲體雙層or單層培養(yǎng)基第十五頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo取培養(yǎng)20h的康氏木霉菌絲體懸液10mL，4000r/min離心30min收集菌絲體，用無菌水4000r/min離心30min洗滌2次，加2.0%蝸牛酶溶液30℃水浴酶解至原生質(zhì)體形成率接近100%時(shí)停止酶解，用0.6mol/LNaCl5min條件下離心洗滌2次，最后將原生質(zhì)體懸于0.6mol/LNaCl溶液中。在原生質(zhì)體制備過程中每隔一定時(shí)間取酶解液制成水封片于顯微鏡下觀察。第十六頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo取原生質(zhì)體懸液1mL與5mL上層再生培養(yǎng)基混勻，傾倒于下層再生培養(yǎng)基平板上，待培養(yǎng)基凝固后于28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。用下式計(jì)算再生率：再生率（%）=（A-B）/C×100%式中：A為經(jīng)高滲溶液稀釋的原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落數(shù)；B為經(jīng)無菌水稀釋的原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落數(shù)；C為顯微鏡下計(jì)數(shù)的原生質(zhì)體數(shù)。第十七頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo培養(yǎng)時(shí)間22h酶種類和濃度單一蝸牛酶，3%酶解時(shí)間2.5h酶解溫度36℃滲透壓穩(wěn)定劑無機(jī)鹽溶液有利于原生質(zhì)體的釋放，而糖醇類不利于原生質(zhì)體釋放（NaCl）原生質(zhì)體制備第十八頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo原生質(zhì)體再生酶種類和濃度單一蝸牛酶，2%酶解溫度30℃滲透壓穩(wěn)定劑糖﹑醇類有利于原生質(zhì)體的再生而無機(jī)鹽類物質(zhì)不利于再生（蔗糖）再生培養(yǎng)基中蔗糖濃度0.8mol/L康氏木霉原生質(zhì)體制備的最適菌齡為22h，蝸牛酶濃度為2.0%，酶解溫度為30℃，酶解時(shí)間為2.5h，蝸牛酶溶液中的滲透壓穩(wěn)定劑為0.6mol/LNaCl，再生培養(yǎng)基中的滲透壓穩(wěn)定劑為0.8mol/L蔗糖第十九頁，共二十一頁，2022年，8月28日CompanyLogo菌絲體培養(yǎng)60h,用1.5%溶菌酶+0.5%蝸牛酶混合酶液,pH值6.0～