雙向電泳的技術(shù)流程和樣品制備

雙向電泳的技術(shù)流程和樣品制備第一頁，共四十一頁，2022年，8月28日基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)基因組學(xué)：蛋白質(zhì)組學(xué)：可視為分子生物學(xué)的大規(guī)模篩選技術(shù)，目的在于歸類細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的整體分布，鑒定并分析感興趣的個(gè)別蛋白，最終闡明它們的關(guān)系與功能。上述兩種學(xué)科的研究?jī)?nèi)容在互補(bǔ)的水平上研究了細(xì)胞的分子架構(gòu)，又都在各自的水平上提供了增強(qiáng)對(duì)方效應(yīng)的信息，因此二者存在有很強(qiáng)的且?guī)в邢到y(tǒng)性相互關(guān)系。第二頁，共四十一頁，2022年，8月28日Applicationsofproteomics

?

Proteinidentification/characterization?Protein-proteininteraction?Post-translationalmodifications?Subcellularlocation?Elucidationofpathway?Targetvalidationandtoxicology?Drugdiscovery第三頁，共四十一頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)組分析的首要要求將來自于全細(xì)胞、組織或生物體中所包含的多達(dá)幾千種混合蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、檢測(cè)和分析。2-DE技術(shù)依然是大多數(shù)蛋白質(zhì)組研究中分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的首選技術(shù)。第四頁，共四十一頁，2022年，8月28日生物學(xué)問題的提出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品的制備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點(diǎn)的切取胰酶對(duì)脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測(cè)序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對(duì)新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白信息的初步獲得第五頁，共四十一頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳圖像分析轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測(cè)序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索新的或已知蛋白蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定第六頁，共四十一頁，2022年，8月28日雙向電泳分析中的樣品制備制備原則：應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測(cè)性。第七頁，共四十一頁，2022年，8月28日可溶性樣品

固體組織樣品

細(xì)胞不同樣品的基本處理方法樣品的分級(jí)處理通過采用亞細(xì)胞分級(jí)、液相電泳和選擇性沉淀等方法對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分級(jí)處理，可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前最簡(jiǎn)單有效的處理是采用分級(jí)抽提，按樣品溶解度不同進(jìn)行分離。第八頁，共四十一頁，2022年，8月28日樣品的溶解是2-DE成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一。溶解的目標(biāo)：1、樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)，相應(yīng)的表示單個(gè)多肽的點(diǎn)的強(qiáng)度會(huì)下降）；2、溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除；3、溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。第九頁，共四十一頁，2022年，8月28日增加樣品溶解性的手段變性劑：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性劑：經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團(tuán)。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。還原劑：在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP）進(jìn)行還原。第十頁，共四十一頁，2022年，8月28日起載體作用的兩性電解質(zhì)：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于PI點(diǎn)時(shí)會(huì)發(fā)生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時(shí)，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2％（w/v)。濃度過高會(huì)使IEF的速度降低。另外，為了保證實(shí)驗(yàn)的精確性，在選擇不同pH范圍的IPG膠條時(shí)，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合。第十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日樣品液的準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)液：ReagentAmount8Murea47mlof8.5stockor24gureain25mlH2O50mMDTTor2mMTBP385mgor500ulof200mMTBPstock4%CHAPS2g0.2%carrierampholytesSeenexttable0.0002%bromophenolblue100ulof0.1%stockddH2OTo50ml第十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日IPGpHRangeBio-LyteAmpholyte(stock)rangeBio-LyteAmpholyte(stock)Conc.(w/v)SampleSolutionVolumePer5mlSampleSolutionVolumePer50ml3-103/1040%25l250l4-74/640%12.5l125l5/740%12.5l125l3-63/540%25l250l4/640%12.l125l5-85/840%25l250l7-107/940%12.5l125l8/1020%25l250lSuggestedBio-lyteampholytecompositionforIPGuse第十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日ReagentAmount7Murea4.1mlof8.5stockor2.1gureain3mlH2O2MThiourea760mg2mMTBP50ulof200mMTBPstock4%CHAPS200mg0.2%carrierampholytesSeetable0.0002%bromophenolblue10ulof0.1%stockddH2OTo5mlMultiplechaotropicagentsolutionpreparation第十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日ReagentAmount5Murea2.9mlof8.5stockor1.5gureain3mlH2O2MThiourea760mg2mMTBP50ulof200mMTBPstock2%CHAPS100mg2%SB3-10100mg0.2%carrierampholytesSeetable40mMTris24.2mg0.0002%bromophenolblue10ulof0.1%stockddH2OTo5mlMultiplesurfactantsolutionpreparation第十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日樣品中核酸的去除對(duì)電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后會(huì)出現(xiàn)假象遷移和條紋。解決方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行降解，或是利用合成載體兩性電解質(zhì)（SCA）同核酸結(jié)合形成復(fù)合物的能力，再通過超速離心來去除復(fù)合物。第十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日亞蛋白質(zhì)組樣品的制備用超離心技術(shù)分離出細(xì)胞器、質(zhì)膜和細(xì)胞核等成分，再用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進(jìn)行溶解。其優(yōu)點(diǎn)是不僅大大減少樣品的復(fù)雜性，而且可對(duì)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。但該法需要專業(yè)儀器，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性。順序抽提法：根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進(jìn)行抽提的方法。第一步：用Tris堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用標(biāo)準(zhǔn)IEF樣品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個(gè)樣品的11%（W/W）。第十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日特殊樣品的制備

低豐度蛋白的分離：盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時(shí)的低豐度蛋白的量，但同時(shí)增加了高豐度蛋白的負(fù)荷，且造成蛋白的疊加效應(yīng)而影響分離。現(xiàn)常用預(yù)分級(jí)＋窄pH膠的微制備技術(shù)進(jìn)行分離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群，再用pH梯度小于2個(gè)pH單位的IPG膠進(jìn)行窄pH范圍的分離。

第十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)（如核糖體）的處理：先將蛋白預(yù)處理以富集，再用特殊pH梯度的IPG膠條（如pH3－12、4-12或10-12）進(jìn)行等電聚焦。其中窄范圍堿性IPG膠（如pH10-12）的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性IPG膠（如pH3-12、4-12）等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液。極端分子量的蛋白質(zhì)：小于8kD和大于200kD的蛋白在常規(guī)IPG-2D上不易看到，這可能是在Tris/glycine緩沖液中，樣品和游離的dodelcylsulfateions持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對(duì)流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽，或者可能是大分子。第十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日一維固相pH梯度等電聚焦（IEFwithIPG）：

IPG膠的材料是Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在pH3~10不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計(jì)算后，將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)通過乙烯鍵共價(jià)聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通過這種方式生成的IPG不會(huì)發(fā)生電滲透作用，因而可以進(jìn)行特別穩(wěn)定的IEF分離達(dá)到真正的平衡狀態(tài)。第二十頁，共四十一頁，2022年，8月28日IPG膠條的重泡脹泡脹的實(shí)質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)入IPG內(nèi)，從而能進(jìn)行接下來的IEF。不同的加樣方法和加樣量會(huì)導(dǎo)致最終結(jié)果的差異：ProteanIEFcell、IPGphor等集成設(shè)備的使用：20mmol/LDTT墊片的使用：溫度的選擇：第二十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日蛋白載樣量影響IPG膠條對(duì)蛋白載樣量的因素包括：待分析的蛋白點(diǎn)的量應(yīng)滿足隨后的質(zhì)譜分析。電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無需考慮太多其它因素。待研究蛋白的豐度：樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。IPG膠條的pH范圍：第二十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量IPGStriplengthAnalyticalLoad(silverstaining)PreparativeLoad(Coomstaining)7cm10~100g/125l200~500ug/125l11cm50~200g/185l250~1000ug/185l17cm100~300g/300l1~3mg/300l第二十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日IPGIEF中pH梯度的選擇

常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長(zhǎng)，預(yù)試驗(yàn)確定。第二十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日預(yù)分步收集細(xì)胞漿細(xì)胞核細(xì)胞膜核糖體及其他特定細(xì)胞成份細(xì)胞分泌成份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6pH3-4pH4-5pH5-6pH6-7pH7-8pH8-9pH9-10pH10-11pH11-12第一步第二步第三步用窄pH范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白陣列那些亞細(xì)胞定位位置的功能蛋白質(zhì)亞蛋白質(zhì)組陣列策略的框架圖3倍3倍第二十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日聚焦時(shí)間的優(yōu)化

理論上講，要獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需最佳時(shí)間是IEF分離達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時(shí)間。聚焦時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。過度聚焦雖然不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會(huì)因?yàn)榛钚运D(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致過多水在IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。最佳時(shí)間的確定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長(zhǎng)度通過經(jīng)驗(yàn)來確定。第二十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日IEF的基本條件Stemp1Stemp2Stemp3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min－－－Linear400040002hr－－－－－－10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmStemp1Stemp2Stemp3totaltotalStemp1Stemp2Stemp311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr－－－－－－－－－－－－－－－－－－20,000V-hr40,000V-hr～30,000V-hr～50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid第二十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日兩維間的平衡

一維結(jié)束后可馬上進(jìn)行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－80°保存數(shù)月。但在二維電泳前一定要進(jìn)行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合，從而在SDS是電泳能順利進(jìn)行。建議方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mMTris（pH8.8）緩沖液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述緩沖液平衡15min。如果用TBP代替DTT則只需一步平衡。第二十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日二維SDS同普通SDS類似。但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，因?yàn)樵贗PG膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認(rèn)為非限制性IEF膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當(dāng)了濃縮膠。第二十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測(cè)理想顯色劑的7S安全（safety）：靈敏（sensitivity）：簡(jiǎn)單（simplicity）：特異性（specificity）：快速（speed）：穩(wěn)定（stability）：兼容性（synergy）：第三十頁，共四十一頁，2022年，8月28日有機(jī)染料和銀染考染靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍；銀染的線性范圍是40倍，靈敏度是考染的100倍。膠體考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)可實(shí)現(xiàn)PAGE的無背景染色，其極限靈敏度為8~10ng，但這種染液會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果。胺基黑常用于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色。銀染的缺點(diǎn)是：對(duì)某些種類的蛋白質(zhì)染色效果差，對(duì)其后的蛋白質(zhì)測(cè)序和質(zhì)譜分析造成影響。這兩種染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。第三十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日負(fù)染能專門提高PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率，但不能用于膜上染色。結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點(diǎn)透明。速度快（5~15min），蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡(luò)合劑如EDTA或Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。它主要適用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)的膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析。該技術(shù)主要包括金屬鹽染料、鋅－咪唑染料等的使用。第三十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日膠體擴(kuò)散染料主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和PVDF膜上的蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。最好的膠體金染色的靈敏度與PAGE膠內(nèi)的銀染類似。這種技術(shù)主要包括印度墨水染料、膠體金屬染料等。第三十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日有機(jī)熒光團(tuán)染料包括共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合的熒光團(tuán)染料兩類。后者最為常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等熒光染料。這三種染料可對(duì)SDS膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行一步染色，約30~60min完成，靈敏度為2~10ng。染色后的凝膠用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室300nm紫外透射儀進(jìn)行照像保存，其線性范圍為3個(gè)數(shù)量級(jí)。這三種染料的電泳染色結(jié)果與在酵母中通過SAGE所獲得的基因表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)范圍相匹配。在Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進(jìn)行免疫染色或Edman測(cè)序來鑒定蛋白質(zhì)。第三十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日金屬螯合染料這是一類與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容的、相對(duì)較新的蛋白質(zhì)顯色試劑，其設(shè)計(jì)專門與常用微量化學(xué)表征過程兼容。它們不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)（包括自動(dòng)化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機(jī)器人剪切儀器、蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等）相結(jié)合。其中SYPRORuby也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料。第三十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日凝膠的圖像處理分析和典型流程凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點(diǎn)檢測(cè)和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞和解釋：2-DE數(shù)據(jù)庫(kù)的建立：第三十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶切包括感興趣蛋白點(diǎn)的挖取、含蛋白質(zhì)凝膠的脫色、膠內(nèi)蛋白質(zhì)的酶切等過程第三十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的基本流程

樣品制備與IPG膠條水化IPG電泳與上樣緩沖液浸潤(rùn)SDS轉(zhuǎn)PVDF膜膠內(nèi)直接染色染色取出蛋白點(diǎn)胰酶等消化濃縮于多孔吸附柱上MAL