生化藥物與基因工程藥物的分析

第五章

生化藥物和基因工程藥物的分析1醫(yī)學(xué)課件ppt1、了解生化藥物、基因工程藥物的定義、種類。2、熟悉質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法。3、掌握生化藥物、基因工程藥物的特點(diǎn)及常用的化學(xué)定量分析方法。本章學(xué)習(xí)要點(diǎn)2醫(yī)學(xué)課件ppt人類用于預(yù)防、治療和診斷疾病的三大主要藥物第一節(jié)概述化學(xué)藥物生物藥物中藥3醫(yī)學(xué)課件ppt生物藥物的分類：生化藥物生物技術(shù)藥物生物制品從生物體分離純化制得的生化基本物質(zhì)，以及用化學(xué)合成、微生物合成或現(xiàn)代生物技術(shù)制得的一類藥物。利用生物體或其組成部分發(fā)展產(chǎn)品的技術(shù)體系即現(xiàn)代生物技術(shù)研制的藥物稱之。應(yīng)用普通的或基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)獲得的微生物、細(xì)胞及各種動(dòng)物和人源的組織和體液等生物材料制備，用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷的藥品。4醫(yī)學(xué)課件ppt一、生化藥物和基因工程藥物的定義1、生化藥物的定義從動(dòng)物、植物及微生物提取的，也可用生物－化學(xué)半合成或用現(xiàn)代生物技術(shù)制得的生命基本物質(zhì)及其衍生物、降解物以及大分子的結(jié)構(gòu)修飾物等。5醫(yī)學(xué)課件ppt2、基因工程藥物的定義先確定對(duì)某種疾病具有預(yù)防和治療作用的蛋白質(zhì)，然后將控制該蛋白質(zhì)合成過程的基因進(jìn)行分離、純化或人工合成，利用重組DNA技術(shù)加以改造，最后將該基因?qū)肟梢源罅可a(chǎn)的受體細(xì)胞中不斷繁殖或表達(dá)，并能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)具有預(yù)防和治療這種疾病的蛋白質(zhì)，通過這種方法生產(chǎn)的藥物稱之。6醫(yī)學(xué)課件ppt1、氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類藥物二、生化藥物和基因工程藥物的種類（一）生化藥物的種類（1）氨基酸及其衍生物：①單氨基酸：亮氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、色氨酸、賴氨酸、甘氨酸等。7醫(yī)學(xué)課件ppt②氨基酸衍生物：N-乙酰-L-半胱氨酸、S-氨基甲酰半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸、谷胺酰胺、S-羥色氨酸。③復(fù)合氨基酸注射液：3S、6S、9S、11S、13S、14S、15S、17S、18S復(fù)合氨基酸注射液。（S代表氨基酸的種類）8醫(yī)學(xué)課件ppt（2）多肽類藥物：①垂體多肽：促腎上腺皮質(zhì)激素、促胃液素、加壓素。②消化道多肽：促胰液素（胰泌素）、胃泌素、抑胃肽。③下丘腦多肽：促甲狀腺素釋放激素、促性腺激素釋放激素、生長激素釋放激素。9醫(yī)學(xué)課件ppt④腦多肽：由人及動(dòng)物腦和腦脊液中分離出來的多肽、蛋氨酸腦啡肽和亮氨酸腦啡肽等。⑤激肽類：血管緊張肽I、II、III等活性肽。⑥其它肽類：谷脫甘肽、降鈣素、睡眠肽、松果肽、血活素（分子量為3000的肽為主成分)。10醫(yī)學(xué)課件ppt（3）蛋白類藥物豬或牛的纖維蛋白原、纖維蛋白、胃膜素（糖蛋白）、水蛭素、肝細(xì)胞生長因子；屬蛋白質(zhì)類激素尚有生長素、催乳素、促甲狀腺素、促泡激素（FSH）、促黃體激素（LH）；植物來源的蛋白類藥物有植物凝集素、天花粉蛋白、蓖麻和相思豆毒蛋白等。11醫(yī)學(xué)課件ppt2、酶類藥物（1）助消化酶類：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶、麥芽淀粉酶。（2）蛋白水解酶類：溶菌酶、胰DNA酶、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶。（3）凝血酶及抗栓酶：凝血酶（豬、牛血）、纖溶酶、尿激酶、蛇毒凝血酶。12醫(yī)學(xué)課件ppt（4）抗腫瘤酶類：L-天門冬酰胺酶、甲硫氨酸酶、組氨酸酶、谷氨酸胺酶。（5）其它酶類：細(xì)胞色素C、超氧化物歧化酶（SOD）、RNA酶、青霉素酶。（6）輔酶：CoA、黃素單核苷酸（FMN）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。13醫(yī)學(xué)課件ppt3、多糖類藥物（1）肝素、硫酸軟骨素A和C、硫酸皮膚素（硫酸軟骨素B）、硫酸角質(zhì)素、透明質(zhì)酸等。（2）類肝素（酸性粘多糖）、鹿茸多糖、殼聚多糖、右旋糖苷、靈芝多糖、豬苓多糖、人參多糖、黃芪多糖等。14醫(yī)學(xué)課件ppt4、脂質(zhì)類藥物卵磷脂、腦磷脂、膽固醇、麥角固醇、B谷固醇、膽汁酸（膽酸與甘氨酸或牛黃酸的結(jié)合物）、鵝脫氧膽酸、膽紅素、原葉琳、血葉琳、亞油酸、花生四烯酸、五-六烯酸、前列腺素系列（PGE1、PGE2、PGE2a和PG12）。15醫(yī)學(xué)課件ppt5、核酸類藥物RNA（包括iRNA-免疫核糖核酸）、DNA（脫氧核糖核酸）、聚肌苷酸、巰基聚胞苷酸、cAMP、AMP、肌苷。此外，有核酪制劑，6-巰基嘌呤、6-硫代嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、5-碘苷和無環(huán)鳥苷等。16醫(yī)學(xué)課件ppt二、基因工程藥物的種類1、激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物（1）人生長激素釋放抑制因子（2）人胰島素（3）人生長激素17醫(yī)學(xué)課件ppt2、細(xì)胞因子類藥物（1）人干擾素（2）人白細(xì)胞介素（3）集落刺激因子（4）促紅細(xì)胞生長素18醫(yī)學(xué)課件ppt3、酶類及凝血因子類藥物單克隆抗體、疫苗、基因治療藥物、白介素、生長因子、反義藥物、腫瘤壞死因子等。19醫(yī)學(xué)課件ppt1、具有一定的生物活性或生理功能，能夠參與、影響和調(diào)控人體代謝和生理功能，對(duì)于某些疾病的治療具有針對(duì)性強(qiáng)、毒副作用小、易為人體所吸收等特點(diǎn)。三、生化藥物和基因工程藥物的特點(diǎn)20醫(yī)學(xué)課件ppt2、分子量不是定值除氨基酸、核苷酸、輔酶及甾體激素等屬化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的小分子化合物外，大部分為大分子物質(zhì)，其分子量一般幾千至幾十萬。對(duì)大分子的藥物而言，即使組分相同，往往由于分子量不同而產(chǎn)生不同的生理活性。21醫(yī)學(xué)課件ppt

3、結(jié)構(gòu)確證難在此類藥物中，由于有效結(jié)構(gòu)或分子量不確定，其結(jié)構(gòu)的確證很難沿用元素分析、IR、UV、NMR、MS等方法加以證實(shí)，往往還要用生化法如氨基酸序列等法加以證實(shí)。22醫(yī)學(xué)課件ppt4、全過程的質(zhì)量控制此類藥物對(duì)熱、酸、堿、重金屬以及pH較敏感，需對(duì)原材料、生產(chǎn)過程和最終產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。23醫(yī)學(xué)課件ppt5、生物活性檢查在制備多肽或蛋白質(zhì)類藥物時(shí)，有時(shí)因工藝條件的變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活。因此，除了用通常采用的理化法檢驗(yàn)外：尚需用生物檢定法進(jìn)行檢定，以證實(shí)藥物的生物活性。

24醫(yī)學(xué)課件ppt6、安全性檢查由于此類藥物性質(zhì)特殊，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，易引入特殊雜質(zhì)和污染物，故常需做安全性檢查。25醫(yī)學(xué)課件ppt7、效價(jià)測定對(duì)酶類藥物需進(jìn)行效價(jià)測定或酶活力測定，以表明其有效成分含量的高低。26醫(yī)學(xué)課件ppt第二節(jié)質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法

一、鑒別試驗(yàn)（一）理化鑒別法

利用化學(xué)法、物理法及生物學(xué)方法來確證生化藥物的真?zhèn)巍Ｓ脴?biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吩谕粭l件下進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。27醫(yī)學(xué)課件ppt1、化學(xué)反應(yīng)法

通常利用藥物與某試劑在一定條件下反應(yīng)，生成有顏色的產(chǎn)物或沉淀進(jìn)行鑒別。例如，溶菌酶的鑒別采用呈色法；胃蛋白酶的鑒別采用沉淀法。28醫(yī)學(xué)課件ppt2、HPLC法

高效液相色譜法:見后29醫(yī)學(xué)課件ppt3、UV法

三磷酸腺苷二鈉的分子中具有共軛系統(tǒng)，能吸收紫外光。本品的0.01mol／L鹽酸水溶液（20μg／ml），在（257±1）nm的波長處有最大吸收。A250nm／A260nm的值應(yīng)為0.17～0.27。30醫(yī)學(xué)課件ppt（二）生化鑒別法

1、酶法：尿激酶是專屬性較強(qiáng)的蛋白水解酶，根據(jù)尿激酶能激活牛纖維蛋白溶酶原，而具有相同作用的鏈激酶不能激活牛纖維蛋白溶酶原而加以區(qū)別，并用直接觀察溶解纖維蛋白作用的氣泡上升法作為判斷指標(biāo)。

31醫(yī)學(xué)課件ppt2、電泳法肝素的鑒別采用糖凝膠電泳法：肝素是由D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子間組成的酸性粘多糖，其水溶液帶強(qiáng)負(fù)電荷，于瓊脂凝膠板上，在電場作用下，向正極方向移動(dòng)，與肝素國家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，其移動(dòng)位置應(yīng)相一致。32醫(yī)學(xué)課件ppt3、樣品脫鹽后等電點(diǎn)聚焦法測定測定藥物的等電點(diǎn)（為出現(xiàn)多條區(qū)帶多個(gè)等電點(diǎn)），同批次同一產(chǎn)品的等電點(diǎn)應(yīng)相同，表明其工藝穩(wěn)定。33醫(yī)學(xué)課件ppt（三）生物鑒別法利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來鑒別藥物。34醫(yī)學(xué)課件ppt二、雜質(zhì)檢查（一）一般雜質(zhì)檢查檢查項(xiàng)目包括氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度或溶液的顏色、水分及干燥失重、熾灼殘?jiān)取?5醫(yī)學(xué)課件ppt（二）特殊雜質(zhì)檢查許多藥物是從生物組織中提取或用微生物發(fā)酵法制得，藥物中易殘存一些雜質(zhì)或其他成分。1、原料藥的純度分析2、生產(chǎn)過程中雜質(zhì)檢查36醫(yī)學(xué)課件ppt三、安全性檢查（一）熱原檢查法（家兔、鱟試劑）（二）異常毒性試驗(yàn)：用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗(yàn)動(dòng)物，觀察其急性毒性反應(yīng)。反應(yīng)的判斷以試驗(yàn)動(dòng)物死亡與否為終點(diǎn)。37醫(yī)學(xué)課件ppt（三）過敏試驗(yàn)（檢查異性蛋白）藥物中若夾雜有異性蛋白，在臨床使用時(shí)易引起病人多種過敏反應(yīng)，輕者皮膚出現(xiàn)紅斑或丘疹，嚴(yán)重者可出現(xiàn)窒息、發(fā)紺、血管神經(jīng)性水腫、血壓下降，甚至休克和死亡。38醫(yī)學(xué)課件ppt（四）降壓物質(zhì)檢查法降壓物質(zhì)是指某些藥物中含有的能導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)，包括組胺、類組胺或其他導(dǎo)致血壓降低的物質(zhì)。來源：用動(dòng)物臟器或組織為原料制備生化藥物，正常組織內(nèi)存在的組胺及部分氨基酸脫羧形成的組胺、酪胺等物質(zhì)。39醫(yī)學(xué)課件ppt（五）無菌檢查法（檢查活菌）由于許多藥物是在無菌條件下制備的，且不能高溫滅菌。因此，無菌檢查就更有必要。中國藥典中幾乎所有的注射用藥如注射用尿激酶等，均做無菌檢查。40醫(yī)學(xué)課件ppt1、無菌檢查的基本步驟：①培養(yǎng)基的制備，為細(xì)菌生長、繁殖提供所必需的營養(yǎng)物質(zhì)─碳源、氮源、維生素、礦物質(zhì)等。②選擇對(duì)照用菌液，供對(duì)照試驗(yàn)用。③具體檢查，如接種、培養(yǎng)等操作。④結(jié)果判斷，得出陰性或陽性的結(jié)論。41醫(yī)學(xué)課件ppt2、注意事項(xiàng)：①無菌檢查的全部過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作法，包括對(duì)操作環(huán)境、試驗(yàn)材料及用具酶滅菌等，防止微生物污染。②應(yīng)避免在有抑菌條件下操作。③從事無菌操作人員應(yīng)具備微生物學(xué)的基礎(chǔ)知識(shí)及一定工作經(jīng)驗(yàn)，否則要經(jīng)過無菌技能的培訓(xùn)，方能從事此工作。42醫(yī)學(xué)課件ppt（六）基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污染物檢查可能雜質(zhì)：殘留DNA、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素等；主要污染物：微生物、熱原、病毒等。主要檢查項(xiàng)目：外源性DNA、其他外源性雜質(zhì)測定43醫(yī)學(xué)課件ppt（七）致突變?cè)囼?yàn)包括：微生物回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)、嚙齒動(dòng)物微核試驗(yàn)等。（八）生殖毒性試驗(yàn)包括：一般生殖毒性試驗(yàn)、圍生期毒性試驗(yàn)。44醫(yī)學(xué)課件ppt四、含量（效價(jià)）測定含量表示方法百分含量，適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥物或經(jīng)水解后變成小分子的藥物。生物效價(jià)或酶活力，適用于酶類、蛋白質(zhì)類等藥物。45醫(yī)學(xué)課件ppt（一）含量測定1、HPLC法2、SDS法（二）效價(jià)測定：采用國際或國家參考品，或經(jīng)國家檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的參考品，以體內(nèi)或體外法測定其生物學(xué)活性，并標(biāo)明其活性單位。46醫(yī)學(xué)課件ppt第三節(jié)常用定量分析方法及其應(yīng)用一、理化法（一）化學(xué)分析法1、重量法：根據(jù)樣品中分離出的單質(zhì)或化合物的重量測定所含成分的含量。（1）提取法（2）揮發(fā)法（3）沉淀法47醫(yī)學(xué)課件ppt（二）電化學(xué)分析法離子選擇性電極：測量離子活度的指示電極。

2、滴定分析法：根據(jù)樣品中某些成分與標(biāo)準(zhǔn)溶液能定量地發(fā)生酸堿中和、氧化還原或絡(luò)合反應(yīng)等進(jìn)行測定。48醫(yī)學(xué)課件ppt（三）光譜分析法1、比色法：樣品與顯色劑可發(fā)生顏色反應(yīng)，依顏色反應(yīng)的強(qiáng)度測定含量。如蛋白質(zhì)的含量測定，可利用蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應(yīng)，而進(jìn)行定量測定。49醫(yī)學(xué)課件ppt2、UV法：樣品或轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物在某一波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與吸收度成正比，則可進(jìn)行定量測定。如蛋白質(zhì)在280nm左右有最大吸收

。3、熒光分光光度法：根據(jù)物質(zhì)被UV光照射后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量測定。50醫(yī)學(xué)課件ppt（四）色譜分析法1、HPLC法（1）RP-HPLC法：適用于肽類、氨基酸、蛋白質(zhì)和多糖的測定。固定相：C8、C18烷基硅烷鍵合相流動(dòng)相：甲醇-水、乙腈-水（甲醇）、乙腈-緩沖液51醫(yī)學(xué)課件ppt（2）高效離子交換色譜法（HPIEC）HPIEC特點(diǎn)如下：①蛋白質(zhì)、多肽的分離是根據(jù)其相應(yīng)的離子化程度而進(jìn)行的。②分離過程是以鹽濃度增大的梯度洗脫法進(jìn)行的③柱效中等并具較高質(zhì)量的活性回收。52醫(yī)學(xué)課件ppt（3）高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）HPGFC特點(diǎn)如下：①活性蛋白質(zhì)可得以回收。②分離是在固定比例的水溶液中進(jìn)行的。③分離是根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽在溶液中相應(yīng)的有效粒徑而進(jìn)行的。53醫(yī)學(xué)課件ppt2、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）HPCE是根據(jù)帶電組分在管中由于其所帶電荷和分子量的大小，即核質(zhì)比不同產(chǎn)生不同的遷移速度而分離。54醫(yī)學(xué)課件ppt類型酶活力測定法：以酶為分析對(duì)象，測定樣品中某種酶的活力或活性，并用活力單位和比活性表示

。酶分析法：以酶為分析工具或分析試劑，測定樣品中酶以外的其它物質(zhì)的含量。二、酶法55醫(yī)學(xué)課件ppt（一）酶活力測定法1、定義：酶活力是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的測定實(shí)際上是測定一個(gè)被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度─可以用單位時(shí)間反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示。56醫(yī)學(xué)課件ppt2、方法（1）終點(diǎn)法：在適當(dāng)?shù)臈l件下，把酶和底物混合，測定生成一定量產(chǎn)物所需的時(shí)間。（2）將酶和底物混合后隔一定時(shí)間，間斷地或連續(xù)地測定反應(yīng)的連續(xù)變化。57醫(yī)學(xué)課件ppt（3）將酶與底物混合后，讓其反應(yīng)一定時(shí)間，然后停止反應(yīng)，定量測定底物減少或產(chǎn)物生成的量。58醫(yī)學(xué)課件ppt（二）酶分析法1、動(dòng)力學(xué)分析法：

通過條件控制，分別使底物、輔酶活化劑或抑制劑的濃度在酶反應(yīng)中起決定反應(yīng)速度的主導(dǎo)作用。則酶的反應(yīng)速度和上述相應(yīng)因素的濃度間將具有確定的比例關(guān)系，通過測定酶反應(yīng)速度即可求出它們的濃度。59醫(yī)學(xué)課件ppt2、總變量分析法（平衡法或終點(diǎn)法）：

根據(jù)被測物質(zhì)（底物）的性質(zhì)，選擇適宜的分析工具酶對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行作用，在反應(yīng)完成后，借助理化方法測出其總變化量，并參考反應(yīng)的平衡點(diǎn)，計(jì)算出被測物的實(shí)際含量或濃度。60醫(yī)學(xué)課件ppt三、電泳法（一）基本原理電泳法是指帶電微粒如蛋白質(zhì)、核苷酸、其他微粒分子或離子在電場的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度泳動(dòng)而使組分分離，再進(jìn)行檢測