實驗病毒血凝和血凝抑制試驗

關于實驗病毒血凝和血凝抑制試驗第1頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三原理與蛋白質分子類似，核酸也是兩性解離分子。在pH3.5時，堿基上的氨基基團解離，而三個磷酸基團中只有一個磷酸解離，整個核酸分子帶正電荷，在電場中向負極泳動；在pH值為8.0~8.3時，堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負電荷，向正極移動。用適應濃度的凝膠介質作為電泳支持物，發(fā)揮分子篩的功能，使得分子大小和構象不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大差異，達到分離的目的。第2頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三載樣緩沖液其中含有的甘油可以使待電泳樣品沉在點樣孔底部，避免樣品漂浮其中含有的溴酚藍（某些還含有二甲苯青）可以作為電泳速度度的指示分子，溴酚藍的遷移位置大約相當于200bp左右的線性DNA分子的遷移位置。第3頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三溴化乙錠溴化乙錠含有一個可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個三環(huán)平面基團。它與DNA的結合無特異性。當染料分子插入后，導致與DNA結合的染料呈現(xiàn)熒光，DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結合的染料本身吸收302nm和366nm的光輻射。這兩種情況下，被吸收的能量在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處發(fā)射出來。溴化乙錠可以用來檢測單鏈或雙鏈核酸（DNA或RNA）。但是染料對單鏈核酸的親和力相對較小，所以其熒光產率也相對較低。有一些低毒產品替代：sybrgreen、sybrgold、genefinder第4頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三電泳準備用透明膠封固玻璃板兩頭，在板一端放置電泳梳子。用1×TAE–buffer配制瓊脂糖凝膠(0.24gAgaros/32ml1×TAE–buffer)，在微波爐中加熱至瓊脂糖溶解。待溶液冷卻至60℃，加入適量Goldview(或溴化乙錠)至微紅，混勻。將溫熱的瓊脂糖凝膠倒入膠模中，凝膠厚度在5-7mm之間。在凝膠完全凝固后，撕去透明膠，小心地將玻璃板移至裝有1×TAE–buffer的電泳槽中，輕輕地拔去梳子，且使緩沖液沒過膠面。第5頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三DNA電泳取9μl的DNA樣品與1μl的10*樣品緩沖液（甘油，溴酚藍，DNA穩(wěn)定劑）混合后，用微量取樣器慢慢將混合物加至樣品孔中。蓋上電泳槽并通電，使DNA向陽極移動。當溴酚藍在凝膠中移出適當距離（根據DNA的大小、1kb和3kb左右的指示劑來判斷）后，切斷電源，取出玻璃板，在紫外燈下觀察，并拍照記錄結果，估測質粒分子量的大小。第6頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三第7頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三質粒DNA3條帶不是超螺旋、線性和開環(huán)這三條帶。堿法抽提得到質粒樣品中不含線性DNA，其實這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復制中間體（即沒有復制完全的兩個質粒連在了一起）。第8頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三第9頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三一實驗目的

1:學會通過雞胚接種增殖的病毒的收集2:掌握病毒血凝和血凝抑制試驗的基本原理和基本操作3：理解病毒血凝和血凝抑制試驗的應用病毒的血凝和血凝抑制第10頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三二實驗原理1:紅細胞凝集某些病毒（如流感病毒，新成疫病毒，麻疹病毒等）擁有血凝素糖蛋白，可與人或某些動物的紅細胞表面的相應受體結合，從而呈現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象。在此，病毒與紅細胞是配體與受體的關系，而不是顆粒性抗原與相應抗體作用的凝集反應。這種凝聚多種病毒都具有，不是完全特異的第11頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三2:紅細胞凝集抑制當病毒被相應抗體中和后，則喪失了凝集紅細胞的功能，即病毒的紅細胞凝集特性被抑制。3:利用已知抗體，可通過紅細胞凝集抑制試驗鑒定某些具紅細胞凝集特性的病毒，同樣也可利用已知病毒抗原，通過紅細胞凝集抑制試驗來測定抗體水平，從而評價疫苗的免疫效果，或動物是否受到病毒感染

血凝抑制試驗是抗原抗體的特異性血清實驗第12頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三4紅細胞的解脫現(xiàn)象某些具紅細胞凝集特性的病毒還擁有神經氨酸酶活性，其可使病毒從紅細胞上解脫下來，因此，血凝試驗的時間太長，可能會在高濃度孔見到類似陰性的反應結果，實驗過程中必須控制好時間。第13頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三

三實驗操作(一)病毒的雞胚接種與培養(yǎng)(二)病毒尿囊液的收集

37度培養(yǎng)72小時的雞胚--放置于4度冰箱,致死雞胚--消毒氣室--用鑷子打開氣室-打開殼膜--用移液器或吸管收集尿囊液于1.5毫升離心管--5000轉,離心5分鐘,以去除細胞沉淀--上清液供血凝和血凝抑制試驗作用.(三)制備1%濃度的雞紅細胞采集新鮮的抗凝血,以生理鹽水洗3次,每次離心5分鐘,轉速為4000轉,最后用生理鹽水配制成1%濃度.第14頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三(四)紅細胞凝集試驗1、50μl的生理鹽水加入96孔微量板A、B行的1-12孔。2、被檢病毒液50μl分別加入A、B行（一行為標準病毒，一行為自己收集的病毒）的第一孔，然后倍比稀釋至第11孔，棄去50μl，12孔為陰性對照。3、加50μl的1%雞紅細胞于每一孔，按病毒的低濃度至高濃度加入。4、混勻、室溫靜止30min。5、確定紅細胞100%凝聚的病毒的最高稀釋度，為HA滴度。第15頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三6、血凝效價（HA）的確定將板直立，首先觀察紅細胞陰性對照，應呈逗點狀。紅細胞凝集孔呈顆粒狀附于孔底。能凝集紅細胞的最高稀釋度即為血凝效價。第16頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三(五)4單位病毒液的配制以出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象的最高稀釋度為1個單位,將原病毒液稀釋成4倍于最高稀釋度的病毒液,即為4單位病毒液.例如:出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象的最高稀釋度是2的9次方(病毒的血凝效價為2的9次方),那么,4單位病毒液就為2的7次方.第17頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三(六)病毒的紅細胞凝集抑制試驗1、加生理鹽水50μl于96孔板的一排的1-12孔。2、加標準血清50μl于一排第一孔，倍比稀釋到第11孔，棄50μl。3、將50μl病毒的4個血凝單位抗原加至1到第11孔