實(shí)驗(yàn)二血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

關(guān)于實(shí)驗(yàn)二血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳第1頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求了解電泳技術(shù)的一般原理學(xué)習(xí)醋酸纖維素薄膜電泳操作技術(shù)測(cè)定人血清中各種蛋白質(zhì)的相對(duì)百分含量第2頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、實(shí)驗(yàn)原理1.電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)中向本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。在一定pH條件下，不同的蛋白質(zhì)由于具有不同的等電點(diǎn)而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場(chǎng)中它們的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此，可使它們分離2.影響電泳遷移率的因素：

內(nèi)在因素：蛋白所帶凈電荷的量、蛋白的大小和形狀

外界因素：電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的pH值、溶液的離子強(qiáng)度和電滲現(xiàn)象3.醋酸纖維素溶于有機(jī)溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為120μm，有很強(qiáng)的通透性，對(duì)分子移動(dòng)阻力很小。該薄膜電泳具有微量、快速、簡(jiǎn)便、分辨力高，對(duì)樣品無(wú)拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)第3頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4.

經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶，從正極端依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，經(jīng)染色可計(jì)算出各蛋白質(zhì)的百分含量。第4頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、實(shí)驗(yàn)器材1.DYY-6C型

雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀和DYY-Ⅲ型電泳槽，均為北京市六一儀器廠生產(chǎn)2.醋酸纖維薄膜（2cm×8cm）3.培養(yǎng)皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。4.點(diǎn)樣器5.濾紙6.載玻片7.鑷子8.玻棒第5頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三四、實(shí)驗(yàn)試劑巴比妥-巴比妥納緩沖液(pH8.6，0.07mol/L，離子強(qiáng)度0.06)

稱取1.66g巴比妥(AR)和12.76g巴比妥納(AR)，置于三角燒瓶中，加蒸餾水約600ml，稍加熱溶解，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，置4℃保存，備用。2.血清蛋白染色(1)染色液(0.5％氨基黑10B)：稱取0.5g氨基黑10B，加蒸餾水40ml，甲醇(AR)50ml，冰乙酸(AR)10ml，混勻溶解后置具塞試劑瓶?jī)?nèi)貯存。(2)漂洗液：取95％乙醇(AR)45ml，冰乙酸(AR)5ml，和蒸餾水50ml，混勻置具塞試劑瓶中貯存。第6頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三五、測(cè)試材料未溶血的人或動(dòng)物血清第7頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三電泳儀由電泳槽和穩(wěn)壓電源兩部分組成，，兩者之間有專門的連線連接。穩(wěn)壓電源用于調(diào)節(jié)電壓和通電時(shí)間。當(dāng)電泳槽和穩(wěn)壓電源連接好后，將點(diǎn)好樣的醋酸纖維薄膜搭在濾紙橋上，蓋上蓋子，通電，調(diào)整好電壓，進(jìn)行電泳。注意電泳槽的電極方向，負(fù)極應(yīng)與醋酸纖維薄膜上的點(diǎn)樣原點(diǎn)在同一側(cè)。目前，該電泳儀已改進(jìn)為數(shù)顯式的DYY-6C型。浸泡：將2×8cm醋酸纖維薄膜迎著光辨別光澤面和無(wú)光澤面。在無(wú)光澤面距短邊一端1.5cm處用鉛筆輕輕畫(huà)一條點(diǎn)樣線，將之置于盛有緩沖液的平皿中，浸泡30min方可用于點(diǎn)樣。點(diǎn)樣：用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的緩沖液，然后平鋪在玻璃板上（無(wú)光澤面朝上）。在另一載玻片上滴一滴血清，點(diǎn)樣器（用蓋玻片的一邊）在血清上蘸一下（可來(lái)回移動(dòng)一次），再將點(diǎn)樣器輕印在加樣線上，使血清滲透到薄膜內(nèi)，形成均勻的直線。操作指南：第8頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三六、操作步驟1.醋酸纖維素薄膜的潤(rùn)濕與選擇將醋酸纖維素薄膜完全浸泡于緩沖液中約30min后，每組取醋酸纖維素薄膜1張，取時(shí)用鑷子夾住薄膜一端，放在折疊的濾紙中，并用它吸干表面液體。2.電泳槽的準(zhǔn)備電泳槽有兩個(gè)互相隔離的槽，各自裝有緩沖液，接不同的電極，紅色為正極，黑色為負(fù)極。每個(gè)槽上都有一根可移動(dòng)的橫桿，濾紙或紗布的一頭搭在橫桿上，另一頭浸入緩沖液中，形成了濾紙橋。兩桿之間的距離調(diào)節(jié)到略小于醋酸纖維薄膜的長(zhǎng)度，點(diǎn)好樣的醋酸纖維薄膜就搭在濾紙橋上。第9頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第10頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3.點(diǎn)樣：點(diǎn)樣時(shí)，先將毛細(xì)血管插入血清中，封住上端，在載玻片的一端均勻涂過(guò)，使樣品連續(xù)、均勻、適量，把載玻片在薄膜毛面上輕而溫和地印一下。點(diǎn)樣區(qū)距陰極端1.5cm處（見(jiàn)圖）。此步是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。

醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點(diǎn)樣位置示意圖（虛線處為點(diǎn)樣位置）第11頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4.電泳將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn)樣面朝下），另一端平貼在陽(yáng)極端支架上(見(jiàn)下圖)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。連接好電泳儀。在室溫下電泳，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度0.3mA/cm膜寬度（24片薄膜則為14.4mA）。通電5min后，調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度0.5mA/cm膜寬度（24片薄膜則為24mA），電泳時(shí)間50min。電泳后，調(diào)節(jié)旋鈕使電流為零，關(guān)閉電泳儀切斷電源。第12頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5.染色：電泳完畢后將薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中浸泡5min6.漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次，直至背景藍(lán)色脫盡，條帶清晰為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜。第13頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三7.記錄和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

漂洗完畢后將薄膜取出,放在濾紙上。將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對(duì)位置進(jìn)行描述、記錄在預(yù)習(xí)本上，并判斷分析其結(jié)果。8.整理好桌面上的儀器和試劑，并注意清潔自己的操作臺(tái)，請(qǐng)老師驗(yàn)收，實(shí)驗(yàn)報(bào)告當(dāng)場(chǎng)交給老師。第14頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三七、注意事項(xiàng)1、薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。2、點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。3、點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。4、點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的毛面上，點(diǎn)樣量要適量，不宜過(guò)多或過(guò)少。5、電泳時(shí)應(yīng)將薄膜的點(diǎn)樣