干細(xì)胞研究方法及進展

關(guān)于干細(xì)胞研究方法及進展第1頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四第一部分干細(xì)胞的概念第2頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四人體并不是由一種細(xì)胞構(gòu)成，而是由２００多種細(xì)胞構(gòu)成的，例如神經(jīng)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞等等。不同的細(xì)胞擔(dān)負(fù)著不同的功能，但是所有這些細(xì)胞，都是由一個細(xì)胞—受精卵發(fā)育而來的?！叭苄浴钡氖芫言诎l(fā)育過程中，不僅不斷地分裂使細(xì)胞的數(shù)目增加，而且還不斷地分化使細(xì)胞的種類增加。所謂“干細(xì)胞”，就是指那些未分化、因而有可能分化成不同類型細(xì)胞的細(xì)胞。

第3頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四干細(xì)胞的概念及分類

干細(xì)胞（Stemcell）:

指存在于胚胎直至成體的具有增殖、自我更新（self-renewal）以及分化潛能的原始細(xì)胞。第4頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四所有的干細(xì)胞都具有兩個最為顯著的特征：一是不斷增殖、自我更新;二是在適宜的環(huán)境條件下可分化并產(chǎn)生不同類型的細(xì)胞。第5頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四分類(按分化潛能分類）全能干細(xì)胞（totipotentstemcells）、多能干細(xì)胞（pluripotentstemcell）單能干細(xì)胞（monopotentstemcell）或稱為專能干細(xì)胞（committedstemcell）。第6頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四哺乳類胚胎卵裂第7頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四Fromeggtoblastocyte(human)第8頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四

全能干細(xì)胞是指能發(fā)育成為一個完整個體的原始細(xì)胞。受精卵、人體8細(xì)胞以前的胚胎每一個卵裂球都能發(fā)育成為一個完整個體，是全能干細(xì)胞。第9頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四

多能干細(xì)胞是指那些分化潛能很“寬”，可分化為多種類型細(xì)胞的原始細(xì)胞.如胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ES細(xì)胞）、胚胎生殖細(xì)胞（embryonicgermcell）、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bonemarrowstromalstemcell）、神經(jīng)干細(xì)胞.第10頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四

單能干細(xì)胞，只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型細(xì)胞分化，如表皮組織基底層的干細(xì)胞、肌肉中的成肌細(xì)胞或叫肌衛(wèi)星細(xì)胞（satellitecell），神經(jīng)元干細(xì)胞只能分化為神經(jīng)元，膠質(zhì)干細(xì)胞只能分化為膠質(zhì)細(xì)胞等。第11頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四按照生存階段分類：

胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞（adultstemcell；somaticstemcells），也稱為組織干細(xì)胞（tissuestemcells）。第12頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四

胚胎干細(xì)胞，是存在于早期胚胎組織中，具有高度增殖能力和多向分化潛能，能分化為三個胚層所有細(xì)胞類型的原始細(xì)胞。

第13頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四

第14頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四Allofthebodytissuesarefromthe

inner

cellmass(內(nèi)細(xì)胞團)Blastocyste(胚泡)Innercellmass(內(nèi)細(xì)胞團)第15頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四ES細(xì)胞的建系第16頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四

第17頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四成體干細(xì)胞指存在于各組織器官的未分化細(xì)胞。在體內(nèi)，它們具有終生自我更新（self-renewal）能力和分化潛能。第18頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四

根據(jù)胚胎干細(xì)胞來源不同，分為：ES細(xì)胞（embryonicstemcells）,來自囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團。EC細(xì)胞(embryoniccarcinomacells)，由畸胎癌（teratocarcinorma)中分離、篩選出的具有增殖，自我更新能力的細(xì)胞。EG細(xì)胞（embryonicgermcells)，由原始生殖細(xì)胞（primordialgermcells)中分離獲得。第19頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四第20頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四EScellsEGcellsCarcinomacells第21頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四成體干細(xì)胞根據(jù)來源分為：骨髓干細(xì)胞

神經(jīng)干細(xì)胞上皮干細(xì)胞肝干細(xì)胞胰腺干細(xì)胞皮膚干細(xì)胞脂肪干細(xì)胞第22頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四

成體干細(xì)胞具有可塑性（plasticity）或橫向分化的特性。這是指某種組織的成體干細(xì)胞可分化為另一種組織的特異細(xì)胞的能力。例如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可分化為心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等.

第23頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四造血細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分化第24頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四已知的成體干細(xì)胞第25頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四第二部分干細(xì)胞的基本特性

第26頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四一、干細(xì)胞的基本特征（一）干細(xì)胞的形態(tài)和生化特征(二)干細(xì)胞的生物學(xué)特征二、干細(xì)胞生存的微環(huán)境三、干細(xì)胞的命運四、世界各國對于干細(xì)胞研究的政策第27頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四一、干細(xì)胞的基本特征（一）干細(xì)胞的形態(tài)和生化特征1．形態(tài)特征：干細(xì)胞通常呈圓形或橢圓形，體積較小，核質(zhì)比較大，胞內(nèi)細(xì)胞器稀少，細(xì)胞內(nèi)RNA含量低。根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征和存在位置、分子標(biāo)記可以辨認(rèn)不同的干細(xì)胞，目前有的干細(xì)胞位置已經(jīng)確定。例如神經(jīng)干細(xì)胞主要分布于室下帶、海馬、紋狀體、嗅球等區(qū)域。第28頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四2．生化特征：不同的干細(xì)胞具有不同的生化標(biāo)志，如角蛋白15是確定毛囊中表皮干細(xì)胞的標(biāo)志分子，nestin為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志分子。利用標(biāo)志分子確定干細(xì)胞位置、尋找和分離干細(xì)胞有重要意義。干細(xì)胞都具有較高的端粒酶活性，這與其增殖能力密切相關(guān)。第29頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四(二)干細(xì)胞的生物學(xué)特征1．干細(xì)胞的自我更新特征干細(xì)胞在體內(nèi)終生都具有自我更新能力，這與祖細(xì)胞（具有優(yōu)先更新能力）不同。其自我更新能力是通過不對稱分裂(asymmetrydivision)和對稱分裂(symmetrydivision)這兩種形式實現(xiàn)的。第30頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四對稱分裂如果產(chǎn)生的兩個子代細(xì)胞都是干細(xì)胞或都是分化細(xì)胞，稱為對稱分裂。不對稱分裂如果產(chǎn)生一個子代干細(xì)胞和一個子代分化細(xì)胞則稱為不對稱分裂。第31頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四2．細(xì)胞的增殖特征1）干細(xì)胞增殖的緩慢性一般情況下,干細(xì)胞處于休眠或緩慢增殖狀態(tài),當(dāng)其接受刺激,分化時，首先要經(jīng)過一個短暫的增殖期，產(chǎn)生過渡放大細(xì)胞(transitamplifyingcell)或稱為“短暫擴充細(xì)胞”,經(jīng)若干次分裂后產(chǎn)生分化細(xì)胞。過渡放大細(xì)胞的作用是可以通過較少干細(xì)胞產(chǎn)生較多的分化細(xì)胞,同時保護干細(xì)胞。

第32頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四2）干細(xì)胞增殖的自穩(wěn)定性自我維持(self-maintenance)或自穩(wěn)定性是指干細(xì)胞可以在生物個體生命區(qū)間自我更新并維持其自身數(shù)目相對恒定性，這也是干細(xì)胞的基本特征之一。第33頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四維持自我穩(wěn)定性是通過多種形式來實現(xiàn)。首先，當(dāng)干細(xì)胞分裂時，無脊椎動物的干細(xì)胞常以不對稱分裂來維持自身數(shù)目的恒定。哺乳動物的干細(xì)胞常常以對稱分裂和不對稱分列這兩種形式進行，但對于群體而言仍然是不對稱分裂。通過這兩種分裂方式協(xié)調(diào)，保證干細(xì)胞數(shù)目相對衡定，同時更適應(yīng)組織再生的需要。第34頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四第35頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四

3．干細(xì)胞的分化特征1）干細(xì)胞的分化潛能干細(xì)胞的分化具有多潛能性，但不同的干細(xì)胞具有的分化潛能不同。

2）干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化和去分化一種組織類型的干細(xì)胞在適當(dāng)條件下可以分化為另一種組織類型的細(xì)胞，稱為干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化(transdifferentiation)或橫向分化。

第36頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四

二、干細(xì)胞生存的微環(huán)境

干細(xì)胞在機體組織中的居所稱為干細(xì)胞巢(stemcellniche)。在干細(xì)胞巢中所有控制干細(xì)胞增殖與分化的外部信號構(gòu)成了干細(xì)胞生存的微環(huán)境。干細(xì)胞是處于靜息、休眠狀態(tài)，還是處于分化狀態(tài)，如處于分化狀態(tài)，又分化為何種類型的細(xì)胞，這主要由干細(xì)胞本身狀態(tài)和所處的微環(huán)境所決定。

第37頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四在干細(xì)胞的微環(huán)境中，對干細(xì)胞影響最大的主要包括以下三個方面：（一）分泌因子（二）細(xì)胞間相互作用（三）胞外基質(zhì)第38頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四三、干細(xì)胞的命運一般生理情況下處于靜止的G0期分裂的干細(xì)胞有5種發(fā)育途徑：自我更新、分化、程序性死亡、遷移和進入休眠期，少數(shù)干細(xì)胞可以轉(zhuǎn)分化。第39頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四四、世界各國對于干細(xì)胞研究的政策

第40頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四英國：

2001年1月，英國在經(jīng)過了包括科學(xué)界、宗教界、企業(yè)界、政界等人士，以及普通老百姓參與的、長達(dá)3年的爭論后，第一個將克隆研究合法化，允許科學(xué)家培養(yǎng)克隆胚胎以進行干細(xì)胞研究，并將這一研究定性為“治療性克隆”?？茖W(xué)家可破壞被生育診所廢棄的胚胎用于干細(xì)胞和其他研究，也可通過試管內(nèi)受精培養(yǎng)研究用胚胎。2002年，倫敦大學(xué)國王學(xué)院干細(xì)胞生物學(xué)實驗室主任斯蒂芬明格的研究小組獲得英國人工授精與胚胎學(xué)管理局頒發(fā)的兩份研究人類胚胎干細(xì)胞衍生許可證之一。之后，成功建立了英國第一個人體胚胎干細(xì)胞系。

第41頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四2004年，英國成立了世界第一家政府性干細(xì)胞銀行，該銀行包括兩個“存儲”人類胚胎細(xì)胞的分支機構(gòu)。它們分別是英國的國王學(xué)院和紐卡斯?fàn)柕纳芯恐行?；布萊爾政府對干細(xì)胞研究也表示強烈支持，希望借此保障英國生物技術(shù)在歐洲的領(lǐng)先地位。此外，英國成功創(chuàng)建了英格蘭東部地區(qū)干細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，以加強該地區(qū)干細(xì)胞研究相關(guān)的學(xué)術(shù)、臨床與商業(yè)機構(gòu)的協(xié)作，促進干細(xì)胞研究的創(chuàng)新及其應(yīng)用，并使該地區(qū)成為未來干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)發(fā)展的領(lǐng)導(dǎo)區(qū)域。第42頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四2005年3月，英國時任首相布萊爾宣布在3年內(nèi)向包括干細(xì)胞研究在內(nèi)的生物技術(shù)領(lǐng)域投資10億英鎊（約合19.2億美元），以維持英國在國際生物技術(shù)界的優(yōu)勢地位。同月，英國時任財政大臣戈登·布朗宣布，政府將在其10年發(fā)展計劃中建立一個全國性的干細(xì)胞研究網(wǎng)絡(luò)，以鞏固英國在該領(lǐng)域的領(lǐng)先地位；培育出克隆羊“多利”的英國科學(xué)家伊恩·威爾莫特也將研究重點轉(zhuǎn)移到了干細(xì)胞研究領(lǐng)域。第43頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四2008年10月，英國議會下院以355票對129票的壓倒性多數(shù)票通過《人工授精與胚胎學(xué)法案》，允許以醫(yī)學(xué)研究為目的的人獸胚胎研究。這是首次表決通過完整的法案草案，意味英國20年來備受爭議的人獸胚胎研究有望首次獲得明確法律支持。這一法案的通過有利于英國奠定干細(xì)胞研究和無性繁殖領(lǐng)域的優(yōu)勢地位。此前的4月，紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)科學(xué)家4月初宣布，用人體皮膚細(xì)胞的細(xì)胞核和剔除了遺傳信息的牛卵細(xì)胞，成功培育出英國首個人與動物的混合胚胎。這一胚胎存活3天，被用于醫(yī)學(xué)研究。第44頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四

美國

美國總統(tǒng)布什于2001年8月4日宣布政府批準(zhǔn)用政府經(jīng)費進行人體胚胎干細(xì)胞的研究，但是只能用于資助已有的人類胚胎干細(xì)胞系的研究，不資助開發(fā)和利用新的人類胚胎干細(xì)胞系。據(jù)說現(xiàn)在已有６０多個人類胚胎干細(xì)胞系，可以無限傳代，足夠科學(xué)家們研究了。第45頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四在干細(xì)胞研究方面，美國一直處于世界領(lǐng)先地位。從最初的骨髓移植算起，干細(xì)胞研究在美國已有30多年的歷史。尤其是上世紀(jì)90年代末期，美國科學(xué)家成功實現(xiàn)人類胚胎干細(xì)胞在體外的生長和增殖，從而掀起了全世界干細(xì)胞工程研究的熱潮。第46頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四長期以來，美國一些宗教界和保守派人士以有關(guān)實驗可能破壞人類胚胎為由極力阻礙干細(xì)胞研究。2001年，布什下令禁止聯(lián)邦基金資助針對從人類胚胎中取得新的干細(xì)胞株的有關(guān)研究，只允許對其他21種干細(xì)胞株進行研究。他還多次對國會支持干細(xì)胞研究的相關(guān)立法行使否決權(quán)。第47頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四奧巴馬3月9日在白宮簽署命令，解除對于用政府經(jīng)費資助人類胚胎干細(xì)胞研究的限制。奧巴馬說，作為一個有信仰的人，我相信人類應(yīng)該盡其所能解除病人的痛苦。奧巴馬此舉將使國家衛(wèi)生總署得以考慮向科學(xué)家提供用于研究數(shù)百種干細(xì)胞株的經(jīng)費。有關(guān)人士表示，此舉將有助于加快美國干細(xì)胞的研究步伐，從而早日為飽受糖尿病、帕金森綜合征等疑難病困擾的患者帶來福音。

第48頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四德國：德國聯(lián)邦議院于2001年1月30日通過法案，允許德國科學(xué)家在嚴(yán)格限制的條件下利用進口的胚胎干細(xì)胞進行研究

第49頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四德國總理施羅德表示德國可以從鄰國進口那些“在本國已被禁止，但鄰國依然允許”的東西。德國衛(wèi)生部長菲舍爾也立即表態(tài)，說德國可以進口胚胎人類干細(xì)胞進行科學(xué)研究。這意味著一個讓人啼笑皆非的局面——強烈反對英國克隆胚胎提取干細(xì)胞的德國將從英國人手中購買干細(xì)胞！

第50頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四加拿大：加拿大衛(wèi)生研究院于2001年3月4日公布對人類ES細(xì)胞研究實行“有限資助”的指導(dǎo)原則，包括對利用醫(yī)療機構(gòu)“剩余”的人類胚胎進行干細(xì)胞的研究將提供資助，但是禁止政府資助在實驗室里進行純粹用于研究人類胚胎或者人類胚胎克隆的研究。

第51頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四日本：

日本在2000年度啟動的“千年世紀(jì)工程”中，把干細(xì)胞工程作為四大重點之一，并把干細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)視為生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域超過歐美的決好機遇。第52頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四韓國2005年5月19日，干細(xì)胞研究和克隆技術(shù)的領(lǐng)軍人物、韓國漢城大學(xué)教授黃禹錫的實驗室宣布成功克隆出世界上首批與病人基因相符的胚胎干細(xì)胞系，這一成果被視為人類胚胎干細(xì)胞研究的重大突破。

第53頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四

韓國科學(xué)家黃禹錫在干細(xì)胞研究領(lǐng)域取得突破性進展

第54頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四

黃禹錫說，我們的下一目標(biāo)是研究如何讓干細(xì)胞發(fā)展為器官的一部分。這并不是短時間內(nèi)就能夠達(dá)成的，因此，現(xiàn)在要做的就是踏踏實實地分階段進行研究。我們將同韓國、美國、歐洲、中國和日本等其它研究小組緊密合作，為使克隆技術(shù)早日實現(xiàn)實用化而努力。

第55頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四黃禹錫認(rèn)為，對于我們的技術(shù)會被利用于復(fù)制人類的疑心是沒有根據(jù)的，我們所研究的是治療性克隆，是為了制造能夠用于治療的細(xì)胞，而不是復(fù)制人類的生殖性克隆，這兩種技術(shù)存在本質(zhì)不同。不要說別人偷走我們的技術(shù)，就是我自己現(xiàn)在想克隆人我都不會，技術(shù)上是不行的。那些說已經(jīng)克隆出人類的，都是謊話。

第56頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四黃禹錫教授表示：“從阿富汗獵犬種公狗身上提取體細(xì)胞，將其與被除去細(xì)胞核的其他狗的卵子結(jié)合在一起，我們用這種‘體細(xì)胞核替換法’制造了克隆受精卵。然后，把該受精卵移植到代理母體內(nèi)，結(jié)果母狗于今年4月24日誕下小狗，小狗的遺傳特征與提供體細(xì)胞的公狗完全相同?！?/p>

第57頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四此前以克隆羊多莉為開始，人們用體細(xì)胞核替換法克隆出老鼠、牛、豬、貓等10多種哺乳動物，但是由于狗的卵子較為奇特，在克隆技術(shù)上的瓶頸一直未能突破。其他動物在卵巢中能夠輕易提取出成熟的卵子，但是狗在排卵時出現(xiàn)的是未成熟的卵子，因此無法馬上用在克隆上。

第58頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四黃禹錫表示：“我們正確掌握未成熟的卵子在體內(nèi)逐漸成熟的場所和時期，在提取適合于克隆的卵子上獲得了成功。通過在動物克隆的最大難關(guān)——狗克隆上取得成功，我們研究組積累了在動物克隆上最高的知識經(jīng)驗?！?/p>

第59頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四美國《科學(xué)》雜志１１日宣布，韓國和美國科學(xué)家成功克隆出了人類早期胚胎，并從中提取出胚胎干細(xì)胞。這是科學(xué)家首次利用克隆技術(shù)獲得人類胚胎干細(xì)胞。

第60頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四漢城國立大學(xué)和美國密歇根州立大學(xué)等機構(gòu)的科學(xué)家參與了這項研究。１６名健康婦女為這項研究志愿捐獻(xiàn)了２４２個卵細(xì)胞以及被稱為卵丘細(xì)胞的體細(xì)胞?？茖W(xué)家們從卵丘細(xì)胞內(nèi)提取出細(xì)胞核，然后將其植入同一位婦女去除了細(xì)胞核的卵細(xì)胞內(nèi)，并采用化學(xué)手段刺激卵細(xì)胞分裂，共有３０個克隆細(xì)胞經(jīng)過約７天的時間發(fā)育到至少幾十個細(xì)胞組成的、被稱為胚囊的早期胚胎階段。第61頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四科學(xué)家們從這些胚囊中分離出２０個內(nèi)層細(xì)胞團，并在此基礎(chǔ)上最終獲得一個人類胚胎干細(xì)胞系。實驗顯示，利用這種辦法獲得的胚胎干細(xì)胞具有多能性，可分化成骨骼細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和未成熟的腦細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。

第62頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四

第63頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四韓國研究人員表示，新成果給治療性克隆的應(yīng)用“打開了大門”?！犊茖W(xué)》雜志總編肯尼迪評論說，新成果確實令人鼓舞，但也應(yīng)該認(rèn)識到，胚胎干細(xì)胞技術(shù)可能還需幾年才能真正投入應(yīng)用。

第64頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四此前，美國先進細(xì)胞技術(shù)公司曾宣布克隆出含十幾個細(xì)胞的人類早期胚胎，但一直未在學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表成果。而其他研究人員進行的人類胚胎克隆和猴子克隆實驗基本未獲成功，一些科學(xué)家甚至認(rèn)為現(xiàn)有克隆技術(shù)無法應(yīng)用于靈長類動物。韓、美科學(xué)家指出，新成果證明，利用來自活體的體細(xì)胞克隆人類早期胚胎并從中獲取干細(xì)胞是可行的。

第65頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四2004年2月,黃禹錫研究小組在美國《科學(xué)》雜志上發(fā)表論文,聲稱成功通過人類體細(xì)胞克隆早期胚胎而提取了干細(xì)胞,為世界首例。2005年5月,他的研究小組又在《科學(xué)》雜志上發(fā)表論文,聲稱培育出與患者的基因相匹配的胚胎干細(xì)胞,這被認(rèn)為是在治療疑難病癥方面取得的突破性進展,因而引起國際科學(xué)界的轟動,也給韓國帶來巨大榮譽。第66頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四但是,對黃禹錫研究成果的疑問接踵而來。先是黃禹錫違反科學(xué)倫理道德,使用該研究組研究員提供的卵子,并隱瞞獲取卵子數(shù)量的行為被揭發(fā);接著,人們又對黃禹錫2005年發(fā)表在《科學(xué)》雜志上的論文的真實性提出質(zhì)疑。黃禹錫則堅稱有人調(diào)換了他培育出的與患者基因相匹配的胚胎干細(xì)胞,并聲稱他掌握了胚胎干細(xì)胞的核心技術(shù),要求調(diào)查委員會對他的研究成果進行重新驗證。

第67頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四盡管否定了黃禹錫兩篇論文，但調(diào)查委員會承認(rèn)，全球首條克隆狗“斯納皮”確系黃禹錫科研成果。這或許是調(diào)查報告唯一能令黃禹錫感到欣慰的一點。

調(diào)查委員會說,黃禹錫領(lǐng)導(dǎo)的科研小組能克隆出“斯納皮”,說明他們的確掌握了一定技巧,但是這項技術(shù)在克隆技術(shù)方面并不突出。鄭明熙說:“他們掌握的只是基礎(chǔ)技術(shù),畢竟他們沒有培育出與患者DNA匹配的胚胎干細(xì)胞系。

第68頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四2007年11月14日，英國著名的科學(xué)刊物《自然》周刊在其網(wǎng)站上發(fā)表了一篇來自美國的科學(xué)論文，不聲不響地爆出了一條為全球矚目的科學(xué)消息：美國科學(xué)家率先克隆出了人類的靈長動物表兄弟猴子的早期胚胎。這意味著自克隆羊多利降生以來就令世人無限遐想的克隆人，已經(jīng)離我們越來越近了。第69頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四這不由得令人又要想起韓國的克隆英雄黃禹錫。根據(jù)2006年1月10日首爾大學(xué)調(diào)查委員會公布的最終調(diào)查結(jié)果，雖然認(rèn)定黃禹錫2004年與2005年發(fā)表在美國《科學(xué)》周刊上的有關(guān)治療性克隆的干細(xì)胞研究成果屬于造假，但對他培育出首例克隆狗的實驗結(jié)果，科學(xué)界仍然沒有否認(rèn)。

第70頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四但僅僅就在一年多時間之后的2007年8月2日，美國《時代》周刊科學(xué)專欄對當(dāng)天發(fā)表在《細(xì)胞干細(xì)胞》（CellStemCell）雜志的一篇論文，發(fā)出了及時的科學(xué)報道和評論：黃禹錫事件獲得意外進展。《時代》周刊的美籍韓裔專欄記者愛麗絲·樸（AlicePark）一直在跟蹤報道該事件。《細(xì)胞干細(xì)胞》是頂級生物學(xué)雜志《細(xì)胞》2007年才創(chuàng)辦的子刊，也是國際干細(xì)胞學(xué)會的會刊。

第71頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四這一次，由哈佛大學(xué)教授達(dá)利（G.Daley）領(lǐng)銜的研究團隊在《細(xì)胞干細(xì)胞》雜志上的文章表明：2004年黃禹錫博士發(fā)表在《科學(xué)》上的成果，已被他們確認(rèn)，黃禹錫建立干細(xì)胞系的方法很可能是一項歷史性的創(chuàng)舉。達(dá)利教授表示，他們研究了黃禹錫論文中報道的那些干細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)其中有些不是來源于核移植體細(xì)胞克隆，而是通過另一條“單性生殖”技術(shù)路線產(chǎn)生的，也就是說是通過對未受精的卵細(xì)胞進行單性培育得到的，它們的細(xì)胞遺傳特性與卵子提供者的細(xì)胞一致，與通過治療性克隆得到的干細(xì)胞一樣，可用于對供體的細(xì)胞移植。達(dá)利教授等人的論文正式確認(rèn)了這一獲取干細(xì)胞的新方法。第72頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四達(dá)利教授在自己的論文發(fā)表后曾不無惋惜地對記者表示，2005年，巔峰時期的黃禹錫還沒來得及認(rèn)識到自己科研內(nèi)容的價值，就已被搞得焦頭爛額，根本無法顧及科研數(shù)據(jù)的分析，制定下一步科研方向。而同時，許多西方學(xué)者卻已經(jīng)看到了一絲曙光。黃禹錫沒有想到，自己的干細(xì)胞竟然是卵子單性生殖的結(jié)果。只要在當(dāng)時認(rèn)識并報道了單性生殖獲取干細(xì)胞的成果，他的工作將遙遙領(lǐng)先，因為這是區(qū)別于體細(xì)胞克隆的一條全新的獲取干細(xì)胞的技術(shù)路線。

第73頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四中國

我國在干細(xì)胞研究方面已經(jīng)取得了和世界同步的發(fā)展。北京大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、上二醫(yī)和四川大學(xué)等高等院校和科研單位相繼成立了專門的干細(xì)胞研究機構(gòu)。2000年10月，國家干細(xì)胞基因工程產(chǎn)業(yè)化基地正式在天津華苑產(chǎn)業(yè)園區(qū)落成，將建設(shè)成為我國最大的干細(xì)胞庫、干細(xì)胞移植中心以及相關(guān)科研用基地及產(chǎn)業(yè)化基地。

第74頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四

北京大學(xué)干細(xì)胞研究中心李凌松教授指出，人們開始嘗試用干細(xì)胞技術(shù)治療某些疾病僅僅只是開始,采用細(xì)胞技術(shù)治療疾病大概至少要經(jīng)歷三個階段：

第75頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四1.把一種組織的成體干細(xì)胞直接移植給相應(yīng)組織損傷的病人以期治療疾病。

第76頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四2.如果掌握了干細(xì)胞向某種組織細(xì)胞分化的條件，就可以在體外對干細(xì)胞進行誘導(dǎo)使之“定向”分化成所需的細(xì)胞；對于某些遺傳性疾病，還可對干細(xì)胞進行基因修飾。對經(jīng)過“定向分化”或“基因修飾”后的干細(xì)胞進行篩選后，把“合格”的細(xì)胞移植給病人。前兩種方法都屬于細(xì)胞替代或者頂多稱其為“組織替代”，樂觀地估計大概需要3～5年可以用于治療糖尿病、帕金森氏癥等。

第77頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四3.干細(xì)胞技術(shù)的理想階段就是希望在體外進行“器官克隆”以供病人移植，雖然“器官克隆”的名詞已不再陌生，但真正在體外形成一個具有空間結(jié)構(gòu)和正常生理功能的人體器官，絕不是五、六年就能實現(xiàn)的，短期內(nèi)這只不過是一個“美好的愿望”。

第78頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四我國衛(wèi)生部對胚胎干細(xì)胞及克隆技術(shù)的研究的態(tài)度：

（一）我國不贊成、不支持、不允許、不接受任何生殖性克隆試驗；（二）我國贊成以預(yù)防、治療疾病為目的的人類胚胎干細(xì)胞研究，并使其在有效監(jiān)控的條件下有序發(fā)展；

（三）我國應(yīng)加強相關(guān)立法、促進克隆技術(shù)安全應(yīng)用和健康發(fā)展。

第79頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四iPS細(xì)胞第80頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四就在人們還沉浸在對黃禹錫的惋惜中時，干細(xì)胞研究又產(chǎn)生了革命性的進展。2007年11月21日，《科學(xué)》周刊和《細(xì)胞》雜志在自己的網(wǎng)站上，同時報道了美國和日本科學(xué)家相似的創(chuàng)新——用類似調(diào)制基因雞尾酒的方法，把幾種基因一起導(dǎo)入細(xì)胞，獲得了胚胎干細(xì)胞。這成為繼體細(xì)胞克隆、單性繁殖之后的第三種方法。

第81頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四干細(xì)胞是一種“原初”類型的細(xì)胞，具有分化成各種組織細(xì)胞的潛能，成體身上的各種細(xì)胞都是早期胚胎中的原初細(xì)胞不斷增殖和分化的結(jié)果。因此，一旦某些組織和器官出了問題，人們可以取出自己的體細(xì)胞，想辦法讓它們回復(fù)到胚胎時期的干細(xì)胞狀態(tài)，再輸入到病變組織，通過干細(xì)胞的增殖和分化重建病變組織，或在體外培養(yǎng)分化成實體器官再植入體內(nèi)。因最初的來源就是自己的細(xì)胞，不會出現(xiàn)排異反應(yīng)。

第82頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四不論是體細(xì)胞核移植還是單性繁殖，目的都是讓成體細(xì)胞回復(fù)到未分化狀態(tài)。這是一個發(fā)育逆轉(zhuǎn)的過程。相對于這兩種方法，那兩組調(diào)酒師科學(xué)家的方法要簡潔許多。他們從基因著手，各自選擇了四種可以刺激細(xì)胞基因組使之回復(fù)到原初狀態(tài)的“返老還童”基因，把它們組合調(diào)配在一起，導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄病毒中。

第83頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四逆轉(zhuǎn)錄病毒是基因治療中一種運載基因的工具，它可以像病毒感染細(xì)胞一樣結(jié)合到細(xì)胞上，將攜帶的基因注入細(xì)胞。通過這個擺渡工具，那些具有調(diào)節(jié)作用的“返老還童”基因就進入了細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞回復(fù)到原初狀態(tài)。這其實也是一種“基因治療”策略：一般的基因治療是將具有治療作用的基因?qū)爰?xì)胞進行表達(dá)，而“雞尾酒”方法導(dǎo)入的則是“返老還童”基因。

第84頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四干細(xì)胞是人體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為各種器官和組織的細(xì)胞，過去只能從胚胎中獲得。2007年11月，美國和日本科學(xué)家分別宣布獨立發(fā)現(xiàn)將普通皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞的方法，得到的干細(xì)胞稱為誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞，又名iPS細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)分別被《自然》和《科學(xué)》雜志評為2007年第一和第二大科學(xué)進展。第85頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四誘導(dǎo)性多功能干(inducedhumanpluripotentstem,iPS)細(xì)胞，也稱誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞。iPS是由一些多能遺傳基因?qū)肫つw等受體細(xì)胞中制造而成，然后進一步進行體外誘導(dǎo)分化，得到理想的細(xì)胞模型。第86頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcells,iPScells）是利用病毒載體將四個轉(zhuǎn)錄因子（Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc）的組合轉(zhuǎn)入分化的體細(xì)胞中，使其重編程為類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞類型。第87頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四Oct4

Oct4是POU家族的轉(zhuǎn)錄因子,維持細(xì)胞的多能性,是體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞所必須的基因。在小鼠和人的ES細(xì)胞中,Oct4表達(dá)的抑制將會導(dǎo)致自發(fā)性分化為滋養(yǎng)層細(xì)胞。Niwa等實驗結(jié)果表明,Oct-4能夠維持ES細(xì)胞未分化狀態(tài)并促進其增殖,并認(rèn)為Oct-4的活化是重編程為多能干細(xì)胞的標(biāo)志。第88頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四Sox2

Sox2是胚胎干細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,其與Oct-4一樣均為體細(xì)胞重編程所必須的基因,除了可與Oct4協(xié)同調(diào)節(jié)維持細(xì)胞的多能性之外,還能促進干細(xì)胞向神經(jīng)外胚層分化。第89頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四c-Myc和Klf4

c-Myc和Klf4不是iPS細(xì)胞形成所必須的基因,其作用是提高克隆形成的效率,當(dāng)同時將二者去除時iPS細(xì)胞將不能生成,因此c-Myc和Klf4在iPS細(xì)胞產(chǎn)生的過程中同樣重要。c-Myc是在人類癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的卟啉-原癌基因,盡管c-Myc可以提高iPS細(xì)胞克隆形成率,但其構(gòu)建的嵌合體小鼠約20%發(fā)生了腫瘤。所以如果將iPS細(xì)胞用于臨床治療,c-Myc基因的轉(zhuǎn)入必須慎重。Klf4即是抑癌基因又是原癌基因,一方面可以促進ES細(xì)胞的自我更新,另一方面在體細(xì)胞中強制表達(dá)可抑制DNA的復(fù)制,阻滯細(xì)胞周期于G1/S期,因此它在細(xì)胞增殖和分化之間起開關(guān)作用。第90頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四制造方法IPS細(xì)胞是由一些多能遺傳基因?qū)肫つw等細(xì)胞中制造而成。在制造過程中，美國研究人員使用了4種遺傳基因，同時加入了7種包括可阻礙特定蛋白質(zhì)合成的物質(zhì)和酶在內(nèi)的化合物，以研究其各自的制造效率。研究結(jié)果顯示，沒有添加化合物時，遺傳基因的導(dǎo)入效率為0.01％—0.05％，而加入了叫“巴爾普羅酸”的蛋白質(zhì)合成阻礙劑之后，導(dǎo)入效率竟升至9.6％—14％。第91頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四如果從這4種遺傳基因中排除導(dǎo)致細(xì)胞癌化的遺傳基因，只使用3種基因，過去的導(dǎo)入效率只有0.001％甚至低，而加入“巴爾普羅酸”之后，其效率也提高了約50倍。研究人員認(rèn)為，這很可能是因為“巴爾普羅酸”可以促進多能遺傳基因的活性。今后，研究人員將就添加化合物是否會使遺傳基因產(chǎn)生變異展開研究，以在提高制造效率的同時保證安全性。第92頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四

iPS細(xì)胞同樣具有自我更新和分化的全能性，從日本科學(xué)家ShinyaYamanaka于2006年第一次發(fā)現(xiàn)這一技術(shù)到現(xiàn)在，科學(xué)家已經(jīng)成功從小鼠，大鼠，獼猴，豬和人的體細(xì)胞中誘導(dǎo)并獲得iPS細(xì)胞，而且誘導(dǎo)技術(shù)也產(chǎn)生了巨大的革新，減少外源轉(zhuǎn)錄因子，使用非整合病毒，質(zhì)粒法等等都能夠產(chǎn)生iPS細(xì)胞，最近，有報道稱利用純蛋白的方法也可以獲得iPS細(xì)胞。第93頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四iPS技術(shù)具有巨大的潛在應(yīng)用價值，利用iPS技術(shù)能夠獲得病人或者疾病特異的多能性干細(xì)胞，這樣可以避免移植過程中的免疫排斥問題，也繞開了人類胚胎干細(xì)胞研究所帶來的倫理問題。此外，掌握疾病特異性iPS細(xì)胞向相應(yīng)疾病中的功能細(xì)胞定向誘導(dǎo)的技術(shù)方法，以此作為模型研究這些疾病的發(fā)病機制，利用以上疾病模型，對現(xiàn)有藥物做出個體化的評估，并發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和篩選新的藥物，將為這些重大性疾病的基礎(chǔ)和臨床研究開辟新的研究方法和技術(shù)平臺。第94頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四但是關(guān)于人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究還處于起步階段，所采用的供體細(xì)胞還僅僅局限在人包皮成纖維細(xì)胞，表皮細(xì)胞，毛囊細(xì)胞等少數(shù)細(xì)胞類型，更為棘手的是，這些細(xì)胞被重編程為iPS細(xì)胞所需要的時間比較長（16-35天），效率很低，這大大增加了在這個過程中細(xì)胞的變異風(fēng)險。因此如何找到一種理想的人類體細(xì)胞來源是所有科學(xué)家都重點關(guān)注的問題。第95頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四2008年４月，美國加利福尼亞大學(xué)科學(xué)家報告稱，他們將實驗鼠皮膚細(xì)胞改造成iPS細(xì)胞，然后成功使其分化成心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及造血細(xì)胞。第96頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四2009年2月，日本東京大學(xué)科學(xué)家宣布，成功利用人類皮膚細(xì)胞制成的iPS細(xì)胞培育出血小板，而且從技術(shù)上說用iPS細(xì)胞培育人類紅細(xì)胞和白細(xì)胞都是可能的；緊接著，日本慶應(yīng)大學(xué)科學(xué)家又宣布，成功用實驗鼠的iPS細(xì)胞培育出鼠角膜上皮細(xì)胞。第97頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四2009年3月伊始，iPS細(xì)胞研究便相繼迎來兩項重大突破。英國和加拿大科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了不借助病毒、安全將普通皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞的方法；美國科學(xué)家則在《細(xì)胞》雜志上宣布，他們可以將iPS細(xì)胞中因轉(zhuǎn)化需要而植入的有害基因移除，且保證由此獲得的神經(jīng)元細(xì)胞的基本功能不受影響。第98頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四2009年7月，iPS細(xì)胞研究在臨床應(yīng)用道路上又邁出非常重要的一步。據(jù)英國《自然》雜志網(wǎng)站23日報道，中國科學(xué)家周琪和高紹榮等人利用iPS細(xì)胞克隆出活體實驗鼠，首次證明iPS細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞一樣具有全能性。該成果讓人們看到了iPS細(xì)胞具有實用性。第99頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四2010年7月27日，日本京都大學(xué)iPS細(xì)胞研究所中川誠人講師的研究小組發(fā)現(xiàn)，制取iPS細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄基因中某一基因為易致癌基因，應(yīng)用目前的技術(shù)克隆出的活體小鼠中一年后的死亡率為７０％，而其中有半數(shù)為得癌而死。該研究小組用一種結(jié)構(gòu)相近的名為「Ｌ－Ｍｙｃ」的轉(zhuǎn)錄基因取代這一基因制取人體干細(xì)胞，得到的干細(xì)胞數(shù)量是之前的5倍，而且將這一技術(shù)應(yīng)用于克隆活體小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，活體小鼠的死亡率降到了１０％。第100頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四2010年7月，巴西圣保羅大學(xué)醫(yī)療系的科研人員最近取得了利用改造皮膚基因獲取誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）的科研成果。科研人員在研究過程中使用了SOX2、C-MYC和另一匿名基因修改人類成人皮膚細(xì)胞，成功將其改造成了iPS細(xì)胞，并避免了腫瘤的產(chǎn)生。目前該研究小組正在繼續(xù)努力以揭示出這些細(xì)胞擁有的其他特點以及其潛在的治療功能。第101頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四當(dāng)然，這種方法也有弊端：逆轉(zhuǎn)錄病毒這個運載工具畢竟是病毒，萬一它們在細(xì)胞里進行病毒復(fù)制，可能誘發(fā)腫瘤。但是，基因發(fā)揮調(diào)節(jié)功能一般都是通過相關(guān)的化學(xué)小分子實現(xiàn)的，因此可以預(yù)期，以目前這個領(lǐng)域的發(fā)展速度，在不久的將來，科學(xué)家應(yīng)該可以對這種方法進行改良：只需給細(xì)胞添加一些可誘導(dǎo)發(fā)育逆轉(zhuǎn)的小分子藥物，就能啟動發(fā)育逆轉(zhuǎn)的開關(guān)，得到人們自己的干細(xì)胞。第102頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四胚胎干細(xì)胞第103頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)原理

胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)的原則是:在促進胚胎干細(xì)胞增殖的同時，維持其未分化二倍體狀態(tài)。胚胎干細(xì)胞一旦分化即失去其全能性，失去二倍體正常核型的細(xì)胞則會大大降低形成嵌合體(chimera)的能力，特別是進入種系形成生殖細(xì)胞的能力。

第104頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四目前體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的方法歸納起來有二大類：有飼養(yǎng)層培養(yǎng)法和無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法。有飼養(yǎng)層培養(yǎng)法主要應(yīng)用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）和SIM小鼠成纖維細(xì)胞耐硫代鳥嘌呤和耐烏苯苷亞系STO細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞；經(jīng)絲裂霉素-C或γ-射線處理終止其分裂后制備成飼養(yǎng)單層(feederlayer)，將胚胎干細(xì)胞種植在這樣的單層上。第105頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四MEF和STO都能分泌促進胚胎干細(xì)胞增殖和抑制胚胎干細(xì)胞自主分化的因子。MEF和STO培養(yǎng)上清中抑制胚胎干細(xì)胞自主分化因子--白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor；LIF）含量在500～1000IU/ml（分泌型）,同時在MEF和STO基質(zhì)上還存在LIF（基質(zhì)型）。第106頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法則是利用各種能分泌抑制分化因子的細(xì)胞制備條件培養(yǎng)基，或在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入重組的LIF制備成條件培養(yǎng)基。如果使用這樣的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞，可以不使用飼養(yǎng)層細(xì)胞，能保證小鼠胚胎干細(xì)胞增殖的同時維持未分化二倍體狀態(tài)。第107頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)胞可作為飼養(yǎng)層的細(xì)胞有二類:小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)和已建系的SIM小鼠成纖維細(xì)胞耐硫代鳥嘌呤和耐烏苯苷亞系STO細(xì)胞。第108頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四飼養(yǎng)單層的制備一定劑量的絲裂霉素-C(mitomycin-C)和γ-射線能夠使細(xì)胞停止分裂，但不至于馬上死亡，可在體外存活一段時間，并保持分泌各種因子的功能。故使用絲裂霉素-C或γ-射線處理飼養(yǎng)細(xì)胞，使之終止分裂，同時仍分泌促進胚胎干細(xì)胞增殖和抑制其自主分化的因子，維持其未分化二倍體狀態(tài)。

第109頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四胚胎干細(xì)胞有飼養(yǎng)層培養(yǎng)

1）用絲裂霉素-C或γ－射線處理后的飼養(yǎng)細(xì)胞種植到預(yù)先用明膠處理的φ1cm的培養(yǎng)孔內(nèi)，做成飼養(yǎng)單層。

2）將分散的胚胎內(nèi)細(xì)胞團小塊吸置飼養(yǎng)層上。一個內(nèi)細(xì)胞團的細(xì)胞放置一個孔。37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

第110頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四胚胎的準(zhǔn)備和培養(yǎng)（1）母小鼠超數(shù)排卵

1）

性成熟前期母小鼠于中午12：00～1：00或下午5：00～6：00腹腔注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）,每只小鼠5～10IU。

2）隔46～48hr腹腔注射人絨毛膜促性腺激素（HCG），每只鼠5～10IU。同時以1：1比例與公鼠合籠。

3）第二天上午觀察母小鼠陰道栓，見栓當(dāng)天上午確定為懷孕0.5d，見栓第四天為懷孕3.5d。

第111頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四（2）胚胎采集

1）斷頸處死懷孕3.5d的母小鼠,在無菌條件下打開腹腔,暴露子宮。

2）鑷住近子宮頸端并剪斷,分離子宮系膜,在輸卵管端剪斷子宮角。

3）

取出子宮,在無菌濾紙上吸干血跡,置入無菌平皿內(nèi)。

第112頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四4）

用1ml無菌注射器吸入沖卵液。從子宮角端進針，保證針頭進入子宮腔內(nèi)，將沖卵液快速推入子宮腔。每側(cè)子宮注入沖卵液0.2～0.5ml,沖卵液會將胚胎沖出。

5）將毛細(xì)吸管在火焰上拉細(xì)，并用砂輪斷末端，制備吸卵針。

6）將盛有胚胎和沖卵液的平皿置于50～100倍的解剖顯微鏡下。用吸卵針收集胚胎。3.5d胚胎一般處于囊胚期，但也可能處于桑椹期，均可使用。第113頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四（3）胚胎培養(yǎng)

1）

取φ3.5cm平皿,用記號筆劃分四等分。在每等分內(nèi)加入胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液做成露滴狀液滴,每個液滴直徑為0.5～1cm。

2）向平皿內(nèi)加入透明石蠟油，以能覆蓋培養(yǎng)液滴為度。

3）將收集好的3.5d胚胎吸置培養(yǎng)液滴內(nèi)。37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天半量換液一次。

第114頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四胚胎干細(xì)胞的分離1）將囊腔充分?jǐn)U展的胚胎移置到制備好的飼養(yǎng)單層上，換上胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液；或移置到無飼養(yǎng)層但加有條件培養(yǎng)基的液滴內(nèi)（制備同前）。

2）繼續(xù)培養(yǎng)。第一天胚胎突破透明帶；48hr左右胚胎貼壁，滋胚層細(xì)胞舒展開并貼附著培養(yǎng)瓶（皿）表面生長，內(nèi)細(xì)胞團（innercellmass，ICM）位于滋胚層細(xì)胞層的中央部位，向上隆起生長。

3）繼續(xù)培養(yǎng)2～4d，內(nèi)細(xì)胞團繼續(xù)增大第115頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四4）將毛細(xì)吸管一端在火焰上拉細(xì)，用砂輪將末端切斷。準(zhǔn)備末端口徑比內(nèi)細(xì)胞團稍大和稍小兩種。

5）

取φ3.5cm的平皿，在平皿內(nèi)做消化液小滴。每個消化液小滴φ0.3～0.5cm。每個平皿可做20個消化液小滴。

第116頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四6）

將內(nèi)細(xì)胞團生長良好的培養(yǎng)平皿置于解剖鏡下或顯微操作儀下，用50～100倍觀察并完成7)～9)的操作步驟。

7）用末端口徑比內(nèi)細(xì)胞團塊稍大的毛細(xì)吸管挑起內(nèi)細(xì)胞團，吸置消化液小滴內(nèi)。第117頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四8）將內(nèi)細(xì)胞團吸至另一消化液小滴，在室溫或37℃下作用約1～5min。改用末端口徑比內(nèi)細(xì)胞團小的毛細(xì)吸管，輕輕吸吹內(nèi)細(xì)胞團塊，使之分散至3～4個細(xì)胞在一起的小團塊。

9）將分散的內(nèi)細(xì)胞團小塊吸至準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)單層上或條件培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)（見后）。第118頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四胚胎干細(xì)胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng)1）用0.1%明膠水溶液處理φ1cm的培養(yǎng)孔。

2）在培養(yǎng)孔內(nèi)加入條件培養(yǎng)基，每孔1ml。

3）將分散的內(nèi)細(xì)胞團小塊吸置于培養(yǎng)孔內(nèi)。一個內(nèi)細(xì)胞團的細(xì)胞放置1個孔。

4）在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

第119頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四胚胎干細(xì)胞的獲得獲得途徑主要有：從早期胚胎獲得2.從原始生殖細(xì)胞獲得3.從移植細(xì)胞(克隆細(xì)胞)獲得第120頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四1．從早期胚胎獲得美國Thompson研究小組是從囊胚期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團中獲得胚胎干細(xì)胞：體外受精卵→囊胚期→去除滋養(yǎng)層→內(nèi)細(xì)胞團,得5株干細(xì)胞系32代(8個月)保持未分化狀態(tài)。發(fā)育免疫切除法培養(yǎng)

傳代第121頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四2．從原始生殖細(xì)胞獲得gearhart小組：流產(chǎn)胎兒性腺嵴原始生殖細(xì)胞獲得5個多能干細(xì)胞系7個月不分化。

思路：原始生殖細(xì)胞是未分化細(xì)胞。分離培養(yǎng)培養(yǎng)第122頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四3．體細(xì)胞移植分化細(xì)胞核(乳腺、皮膚細(xì)胞)去核卵細(xì)胞→雜合細(xì)胞發(fā)育成囊胚胚胎干細(xì)胞成體(如多利羊)。

移植刺激分離發(fā)育第123頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四胚胎干細(xì)胞的主要特征第124頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四形態(tài)和生化特征1.形態(tài)：細(xì)胞體積小，核大，1~多個核仁。離體培養(yǎng)可產(chǎn)生密集的多細(xì)胞克隆。2.生化特征：端粒酶活性高。3.干細(xì)胞物理特性：如干細(xì)胞對Hoechst33324和Rhodamine123染料不著色。第125頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四4.

干細(xì)胞表面免疫原性：一般表達(dá)胚胎早期的表面抗原，而且有種屬差異。如小鼠胚胎干細(xì)胞表達(dá)胚胎階段性特異抗原-1(SSEA-1)，不表達(dá)SSEA-3或SSEA-4；人胚胎干細(xì)胞表達(dá)SSEA-3或SSEA-4。第126頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四干細(xì)胞的分離與純化1.借助細(xì)胞的生化特征及物理特性，采用熒光細(xì)胞分離器從單細(xì)胞懸液中即可分離純化干細(xì)胞。2.干細(xì)胞的理化特征與其分化調(diào)控有關(guān)，如上皮干細(xì)胞高表達(dá)β1整合素，介導(dǎo)干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附，抑制干細(xì)胞分化。第127頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四胚胎干細(xì)胞的分化潛能胚胎干細(xì)胞是全能(多能)性干細(xì)胞，具有分化為各種組織細(xì)胞的潛能。移植實驗:人胚胎干細(xì)胞小鼠體內(nèi)畸胎瘤(良性)→有三個胚層產(chǎn)生的組織：胃上皮(內(nèi)胚層)骨、軟骨、平滑肌、橫紋肌等(中胚層)神經(jīng)表皮、神經(jīng)節(jié)復(fù)層磷狀上皮等(外胚層)第128頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四骨髓干細(xì)胞第129頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的有關(guān)基礎(chǔ)研究及應(yīng)用現(xiàn)狀

MSC具備干細(xì)胞的兩個重要特征:強的自我增殖能力和多分化潛能。具有向骨、軟骨、脂肪、肌肉(心肌)及神經(jīng)細(xì)胞等組織分化的潛能。MSC起源于中胚層,理論上講,它應(yīng)可以向其它中胚層組織分化。第130頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四MSC的培養(yǎng)方法目前常用的分離MSC的方法有全骨髓法和密度梯度離心法，全骨髓法即根據(jù)干細(xì)胞貼壁特性，定期換液除去不貼壁細(xì)胞，從而達(dá)到純化MSC的目的。密度梯度離心法即根據(jù)骨髓中細(xì)胞成分比重的不同，提取單核細(xì)胞進行貼壁培養(yǎng)。隨著對MSC表面抗原認(rèn)識的深入，有人利用免疫方法如流式細(xì)胞儀法、免疫磁珠法等對其進行分離純化，但經(jīng)過流式或磁珠分選后的細(xì)胞出現(xiàn)了增殖緩慢等一些問題，加之耗費較大和技術(shù)的難度，在某種程度上限制了這些方法的廣泛應(yīng)用。

第131頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四1999年,Pittenger等用地塞米松、β-甘油磷酸等在體外培養(yǎng)條件下將其誘導(dǎo)分化成骨組織;在培養(yǎng)體系中加入ＴＧＦ-3即可促使ＭＳＣ向軟骨分化;用1-methyl-3-isobutylxanthine、地塞米松、胰島素及消炎痛處理,可成功誘導(dǎo)分化為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)富集的脂質(zhì)小泡的脂肪細(xì)胞。第132頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四Ｍakino等在小鼠骨髓細(xì)胞中加入5-azacytidine培養(yǎng)24ｈ,然后顯微鏡下分離能自發(fā)跳動的細(xì)胞克隆。分離的細(xì)胞再加入5-azacytidine培養(yǎng)24ｈ,篩選出自發(fā)跳動頻率最高的細(xì)胞約占細(xì)胞總數(shù)的30%。電子顯微鏡下細(xì)胞類似于心肌細(xì)胞,包括典型的肌小節(jié),位于細(xì)胞中央的細(xì)胞核,而且這些細(xì)胞能分泌心房利鈉肽和腦利鈉肽。應(yīng)用單克隆抗體免疫組化的方法分析細(xì)胞的肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈、肌動蛋白后發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞類似于胚胎心肌細(xì)胞。

第133頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四國內(nèi)項鵬等首次用硫代甘油和丹參注射液誘導(dǎo)人ＭＳＣ分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶、神經(jīng)絲蛋白。第134頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四近期研究表明，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下MSC不僅可以分化為中胚層的間質(zhì)組織，還保持有內(nèi)外胚層的分化潛能，可分化為神經(jīng)細(xì)胞、肺臟、上皮等。將MSC與胎鼠的中腦或紋狀體細(xì)胞共同培養(yǎng)，它可分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，而將MSC移植到心肌缺血壞死區(qū)周圍，3周后漸與周圍心肌細(xì)胞相似，并可見大量新生血管在新生心肌細(xì)胞周圍，這些均表明MSC的分化趨勢與周圍微環(huán)境密切相關(guān)。因此有人推論MSC的分化由特殊轉(zhuǎn)錄因子決定，不同的誘導(dǎo)條件可以決定其分化方向，可能是這些誘導(dǎo)條件啟動了決定分化方向的轉(zhuǎn)錄因子。第135頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四MSC的體外誘導(dǎo)分化亦印證了以上說法。Sanchez-Ramous發(fā)現(xiàn)表皮生長因子或腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子可誘導(dǎo)人及小鼠的少數(shù)MSC分化為神經(jīng)元樣及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。Deng等研究證明，用能提高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的誘導(dǎo)劑，如異丁甲基黃嘌呤、二丁?；鵦AMP等處理后6d,大約25%的MSC定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并且分化是不可逆的。第136頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四研究證明，MSCs在不同的體外環(huán)境誘導(dǎo)下可向不同組織分化。目前誘導(dǎo)分化的方法可大致分為兩種：一是在化學(xué)藥物作用下誘導(dǎo)MSCs進行分化；二是在不同細(xì)胞因子作用下誘導(dǎo)MSCs進行定向分化。第137頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四MSCs在體外分化研究中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)元的物質(zhì),包括一些抗氧化劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子和生長因子以及損傷或正常的神經(jīng)組織勻漿上清液等。Woodbury等用二巰基乙醇(2-ME)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)和丁化羥基苯甲醚(butylatedhydroxyanisole,BHA)等一些抗氧化的物質(zhì)具有誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)元作用,表達(dá)神經(jīng)元特有的標(biāo)記如NF、Neu、Tau和NSE等。第138頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四Sanchez-Ramos等使用了EGF或BDNF與視黃酸(retinoicacid,RA)等組合將MSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞。這些抗氧化劑誘導(dǎo)MSCs分化的確切機制尚不清楚,可能與其抗氧化特性、提高神經(jīng)元在體外的存活有關(guān)。第139頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四Jin等應(yīng)用EGF、FGF-2、RA、NGF等不同組合,進行誘導(dǎo)MSCs分化,分化細(xì)胞形成神經(jīng)元樣突起,表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物,但是,不同生長因子誘導(dǎo)所表達(dá)的標(biāo)志物在細(xì)胞內(nèi)的分布不同。Chen等發(fā)現(xiàn),用創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的腦提取物培養(yǎng)人的MSCs,則MSCs產(chǎn)生BDNF、NGF、VEGF、HGF顯著增加。第140頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四創(chuàng)傷腦組織提取液可產(chǎn)生一些生長因子如bFGF、PDGF等。因此,認(rèn)為這些神經(jīng)營養(yǎng)因子能促進MSCs的自(旁)分泌作用,產(chǎn)生NGF、BDNF、M-CSF、VEGF、HGF等,從而作用于神經(jīng)元的相應(yīng)的受體,通過受體信號傳導(dǎo)系統(tǒng)激活生存信號、失活死亡信號,并啟動分化機制,且產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞保護作用。第141頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四MSCs在體內(nèi)分化為神經(jīng)細(xì)胞,其機制可能更為復(fù)雜。MSCs與宿主腦相互作用導(dǎo)致MSCs自分泌或旁分泌營養(yǎng)因子增加,可能有助于損傷神經(jīng)功能的恢復(fù)。MSCs分泌巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)、干細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等,還產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(neuralcelladhesionmolecule,N-CAM)和神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)等,這些細(xì)胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子是細(xì)胞得以存活、生長、分化的重要物質(zhì)。第142頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四Mahmood等用腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)或神經(jīng)生長因子(NGF)進行對MSC體外培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)BDNF或NGF組比未用組在腦創(chuàng)傷鼠腦內(nèi)存活MSC數(shù)量明顯增多,神經(jīng)功能恢復(fù)也明顯高于未用組,移植存活的細(xì)胞表達(dá)NeuN、MAP-2和GFAP,可見BDNF或NGF等能促使MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。第143頁，共161頁，2023年，2月20日，星期四MSC的移植途徑：①直接側(cè)腦室注射，經(jīng)立體定位儀定位后進行側(cè)腦室穿刺，將擴增的MSC移植于側(cè)腦室，使之隨腦脊液到達(dá)病變部位；②腰穿椎管內(nèi)植入，將擴增的MSC移植入蛛網(wǎng)膜下腔，使之隨腦脊液到達(dá)病變部位；③直接注射，符合外科適應(yīng)證的患者，在開顱后將擴增的MSC