Notch信號(hào)通路對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)分化無影響,神經(jīng)生物學(xué)論文

Notch信號(hào)通路對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)分化無影響,神經(jīng)生物學(xué)論文Notch信號(hào)通路在生物進(jìn)化中具有高度保守性，介入生物體內(nèi)諸多重要生命經(jīng)過，如細(xì)胞的增殖、分化、存活、凋亡等．蛋白O-連接巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶1(proteinO-fucosyltransferase1，Pofut1)介入Notch受體蛋白中蛋白-O-連接巖藻寡糖的合成，Pofut1基因缺失使得Notch受體蛋白構(gòu)造發(fā)生改變而無法與相應(yīng)配體結(jié)合，導(dǎo)致Notch信號(hào)無法傳遞．在哺乳動(dòng)物中Notch有4種受體(Notch1，2，3，4)、2種Jagged配體(Jagged1，2)和3種Delta配體(Delta1，3，4)．Notch信號(hào)分子與相鄰細(xì)胞外表配體結(jié)合，激活A(yù)DAM蛋白酶(Adistintegrinandmetalloprotease)使之水解，產(chǎn)生Notch的胞外區(qū)，在分泌酶復(fù)合體介導(dǎo)下，釋放Notch蛋白的可溶性胞內(nèi)區(qū)(Notchintracellulardomain，NICD)并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄抑制因子CSL(CBFl/SuppresorofHairless/Lag1)結(jié)合，誘導(dǎo)其下游靶基因如Hes1、Hes5等的表示出．有研究證實(shí)，在胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化經(jīng)過中，Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化狀態(tài)對(duì)細(xì)胞分化經(jīng)過發(fā)揮重要作用．本研究應(yīng)用Pofut1基因敲除小鼠胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，研究Notch信號(hào)通路對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)分化的影響．結(jié)果表示清楚，Notch信號(hào)傳遞能力缺失對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯影響，但對(duì)擬胚體的構(gòu)成和向神經(jīng)細(xì)胞分化起到促進(jìn)作用．1材料與方式方法1.1材料Pofut1基因敲除胚胎干細(xì)胞(ESC)和對(duì)照的野生型ESC，以及飼養(yǎng)層SNL2細(xì)胞由美國愛因斯坦醫(yī)學(xué)院PamelaStanley教授惠贈(zèng)．低粘附的6孔培養(yǎng)板(Cat#3471)購自StemCell公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司;實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自MJ公司;全反式維甲酸購自Sigma公司．抗O4、GFAP(glialfibrillaryacidicprotein)和NFM(neurofilamentmedium)單克隆抗體購自Chemicon公司;驢抗兔、抗山羊IgG購自JacksonImmunology公司．其余用于ESC分化的常規(guī)培養(yǎng)用器材購自BD公司．1.2細(xì)胞培養(yǎng)飼養(yǎng)層細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，將3105細(xì)胞鋪在10cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)．胚胎干細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在鋪有單層飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、1000ULIF/mL的DMEM，于37℃培養(yǎng)．1.3擬胚體的構(gòu)成和神經(jīng)細(xì)胞的分化胚胎干細(xì)胞經(jīng)胰酶消化成單細(xì)胞，并重新懸浮于EB(embryoidbody)培養(yǎng)基(含15%EB級(jí)胎牛血清的DMEM)，以5104細(xì)胞接種于低粘附的6孔板中，應(yīng)用RA4+4－懸浮培養(yǎng)8d以構(gòu)成擬胚體，前4d培養(yǎng)基中含5107細(xì)胞全反式維甲酸，后4d去除維甲酸．EB繼續(xù)在預(yù)先包被poly-L-ornithine/laminin的細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)8d，使EB分化構(gòu)成神經(jīng)細(xì)胞，并于顯微鏡下觀察分化細(xì)胞的形態(tài)．1.4細(xì)胞免疫組化染色用預(yù)先包被poly-L-ornithine/laminin的蓋玻片培養(yǎng)生長(zhǎng)分化的細(xì)胞，經(jīng)4%多聚甲醛固定30min，0.5%TritonX-100/PBS室溫處理5min，參加1∶400兔抗NFM抗體，或者1∶100羊抗GFAP或者1∶500羊抗O4抗體，于4℃孵育過夜，經(jīng)PBS清洗3次，參加熒光標(biāo)記(FITC或者羅丹明)1∶100驢抗IgG，37℃孵育1h，PBS清洗3次，100g/mLDAPI染色1h，水洗后，以Anti-fadegoldTMmountMedium封片．1.5Real-timePCR分析用Trizol提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作講明進(jìn)行cDNA第一鏈合成，并以此為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因表示出，引物序列見Table1，根據(jù)操作講明書進(jìn)行．PCR反響程序:95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共45個(gè)循環(huán)．基因相對(duì)表示出量應(yīng)用2－Ct法計(jì)算，以GAPDH作為內(nèi)參基因．1.6統(tǒng)計(jì)分析本文統(tǒng)計(jì)分析采用Studentst檢驗(yàn)，使用GraphPadPrism軟件進(jìn)行分析．2結(jié)果2.1Pofut1缺失對(duì)ES細(xì)胞生長(zhǎng)的影響研究表示清楚，Pofut1負(fù)責(zé)催化Notch家族分子(包括Notch1～4)細(xì)胞外段的O-巖藻糖化，該基因的突變將導(dǎo)致Notch家族所有成員均無法與相應(yīng)配體結(jié)合，進(jìn)而不能啟動(dòng)和傳遞Notch信號(hào)．因而，Pofut1基因敲除小鼠表型比單一Notch分子敲除小鼠更為嚴(yán)重．本文首先分析了Notch信號(hào)缺失對(duì)ES細(xì)胞增殖的影響，F(xiàn)ig．1結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在Notch信號(hào)缺失時(shí)，體外培養(yǎng)ES細(xì)胞本身的生長(zhǎng)未見明顯影響．2.2Pofut1缺乏對(duì)擬胚體構(gòu)成的影響擬胚體的構(gòu)成是ES細(xì)胞體外分化的必經(jīng)經(jīng)過，擬胚體在構(gòu)造上能夠模擬早期胚胎發(fā)育經(jīng)過，包括在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)外表構(gòu)成內(nèi)胚層、柱狀上皮細(xì)胞的分化，以及空腔的構(gòu)成．Notch信號(hào)缺失的ES細(xì)胞構(gòu)成的擬胚體(EB)數(shù)量增加(Fig．2A)，并且構(gòu)成的EB體積增大，形狀相對(duì)不規(guī)則，且大小不均一(Fig．2B)．2.3Pofut1缺乏對(duì)神經(jīng)細(xì)胞纖維的影響經(jīng)過維甲酸(RA)誘導(dǎo)后的擬胚體在鋪有poly-L-ornithine/laminin的培養(yǎng)皿中繼續(xù)分化，部分貼壁生長(zhǎng)的EB向外生長(zhǎng)分化為具有分支的神經(jīng)樣細(xì)胞團(tuán)，見Fig．3B～D，缺乏Notch信號(hào)的EB與正常對(duì)照的EB相比，產(chǎn)生具有神經(jīng)樣的細(xì)胞明顯比對(duì)照組多(Fig．3E)，表示清楚Notch信號(hào)缺失有助于ES細(xì)胞經(jīng)過EB向神經(jīng)細(xì)胞分化．2.4Pofut1缺乏對(duì)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志分子的影響為確認(rèn)Notch信號(hào)傳遞系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞分化的影響，應(yīng)用神經(jīng)細(xì)胞特異性的單克隆抗體，對(duì)貼壁生長(zhǎng)的分化細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果如Fig．4．抗神經(jīng)纖維(neurofilamentmedium，NFM)單克隆抗體在突變的ES分化細(xì)胞中被標(biāo)記，神經(jīng)纖維明顯長(zhǎng)于對(duì)照組;星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP(glialfibrillaryacidicprotein)和少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記分子O4的免疫組化結(jié)果表示清楚，在突變EB分化的神經(jīng)細(xì)胞中的表示出強(qiáng)于對(duì)照組．2.5Pofut1缺乏對(duì)神經(jīng)分化經(jīng)過中Notch靶基因表示出的影響進(jìn)一步應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析了Notch信號(hào)缺失對(duì)靶基因Hes1表示出的影響．如Fig．5結(jié)果顯示，無論在ES向神經(jīng)分化前或后，Pofut1基因表示出缺失對(duì)Notch1基因本身的表示出均沒有明顯影響;在ES細(xì)胞分化前，Pofut1缺失與對(duì)照組相比靶基因Hes1的表示出未見差異不同，但在ES分化后，Pofut1缺失組Hes1基因的表示出則明顯下降(P＜0.01)．3討論Notch信號(hào)系統(tǒng)幾乎牽涉所有細(xì)胞的增殖和分化活動(dòng)，普遍達(dá)到胚胎發(fā)育期的各種組織及各種成熟組織中未分化并具有增殖能力的細(xì)胞，是影響細(xì)胞命運(yùn)的保守而重要的信號(hào)通路之一．研究表示清楚，Notch信號(hào)系統(tǒng)激活能抑制胚胎干細(xì)胞的分化，當(dāng)Notch與其配體結(jié)合后胚胎干細(xì)胞進(jìn)行增殖，當(dāng)Notch活性被抑制時(shí)，干細(xì)胞進(jìn)入分化程序，進(jìn)而發(fā)育為功能細(xì)胞．Notch受體胞外段的EGF(epidemicgrowthfactor)重復(fù)序列能被Pofut1所修飾．Pofut1基因敲除小鼠具有其體內(nèi)所有Notch信號(hào)通路被阻斷的特點(diǎn)，并導(dǎo)致其體內(nèi)全部Notch受體信號(hào)失活的表型．本文應(yīng)用Pofut1基因敲除的ES細(xì)胞，討論了Notch對(duì)ES細(xì)胞向神經(jīng)分化的影響．結(jié)果表示清楚，Notch信號(hào)缺失不影響ES細(xì)胞的增殖．但在誘導(dǎo)神經(jīng)分化經(jīng)過中促進(jìn)擬胚體數(shù)量增加、體積增大;分化后Notch信號(hào)缺失的ES細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)樣細(xì)胞明顯增加，且神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物如NFM、GFAP以及O4等的表示出明顯增加，講明Notch信號(hào)缺失能夠促進(jìn)ES細(xì)胞經(jīng)EB向神經(jīng)的分化．基因表示出分析表示清楚，在Pofut1缺失的分化細(xì)胞中，Notch1表示出沒有明顯變化，但其下游靶基因Hes1轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，講明Pofut1缺失不影響Notch基因本身的表示出但抑制Notch下游靶基因的表示出．曾有研究結(jié)果以為，在哺乳動(dòng)物ES細(xì)胞中缺失Pofut1后，其細(xì)胞外表仍然具有與野生型一樣水平的Notch受體，但是其不能與Notch配體相結(jié)合，并使Notch信號(hào)通路全部被阻斷．這與本文利用real-timePCR檢測(cè)ES、EB細(xì)胞中Notch1和Hes1轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果一致．某些研究顯示，Notch信號(hào)對(duì)于神經(jīng)軸突抑制生長(zhǎng)和維護(hù)具有重要作用．Sestan等和Berezovska等證實(shí)，激活Notch能夠抑制神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)或使神經(jīng)軸突萎縮，而抑制Notch1信號(hào)能夠促進(jìn)神經(jīng)軸突的延伸．Tanigaki等利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將活化的Notch1和Notch3轉(zhuǎn)入大鼠海馬區(qū)，發(fā)現(xiàn)少突膠質(zhì)細(xì)胞則減少．同時(shí)，Sdrulla等發(fā)現(xiàn)，在視神經(jīng)中Notch也能夠抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的發(fā)生．本文結(jié)果表示清楚，在EB向神經(jīng)分化經(jīng)過中少突膠質(zhì)細(xì)胞在Notch信號(hào)缺失下明顯多于對(duì)照組，這與上述研究結(jié)果相符．Ramasamy等研究表示清