口腔基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)進(jìn)展：7 熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)

熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)課程內(nèi)容實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)試劑及耗材操作步驟應(yīng)用舉例重點(diǎn)內(nèi)容Luciferase報(bào)告基因系統(tǒng)以熒光素(luciferin)為底物來檢測(cè)螢火蟲熒光素酶(firefly

luciferase)活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會(huì)發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。然后可以通過熒光測(cè)定儀也稱化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測(cè)定儀測(cè)定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試結(jié)合螢火蟲和海腎熒光素酶的共報(bào)告基因測(cè)試技術(shù)在用螢火蟲熒光素酶定量基因表達(dá)時(shí),通常采用第二個(gè)報(bào)告基因來減少實(shí)驗(yàn)的變化因素。體外分泌的熒光素基因:目前NEB公司提供新型的可在細(xì)胞外分泌的熒光素酶,分別是Gluc和Cluc,具體使用幫助可在NEB官方網(wǎng)站找到.轉(zhuǎn)錄因子活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理（1）構(gòu)建一個(gè)將靶啟動(dòng)子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等（2）將要檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒，與報(bào)告基因質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子則熒光素酶基因就會(huì)表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度呈正比。（3）加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。生物信息分析序列插入和質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)miRNA活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理（1）構(gòu)建一個(gè)將靶3’-UTR的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列后方的報(bào)告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等（2）將要檢測(cè)的miRNA，與報(bào)告基因質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。如果此miRNA能夠抑制靶3’-UTR則熒光素酶基因表達(dá)降低，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度呈反比。（3）加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定熒光素酶的活性，從而判斷miRNA是否能與此靶3’-UTR片段有作用。生物信息分析序列插入和質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)試劑及耗材雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒：實(shí)驗(yàn)試劑及耗材轉(zhuǎn)染試劑HEK293細(xì)胞（人腎上皮細(xì)胞系）實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備轉(zhuǎn)錄因子活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟（1）用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。（2）設(shè)計(jì)引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動(dòng)子片段，將此片段插入熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-basic（3）篩選陽性克隆，測(cè)序。擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。（4）擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒，提純備用。同時(shí)準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對(duì)照，提純備用（5）培養(yǎng)目的細(xì)胞，并接種于24孔板中，生長(zhǎng)10-24小時(shí)（80%匯合度）。（6）將報(bào)告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞（7）提取蛋白并用于熒光素酶檢測(cè)。（8）加入底物，測(cè)定熒光素酶的活性。（9）計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度，并與空載對(duì)照比較。http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/3’UTR序列查詢3’UTR序列查詢3’-UTR生物信息分析序列插入和質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)儀器使用應(yīng)用舉例應(yīng)用舉例活體動(dòng)物成像原理：以熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞或動(dòng)物模型應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)本次課程重點(diǎn)內(nèi)容應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子活性實(shí)驗(yàn)原理應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miRNA活性實(shí)驗(yàn)原理轉(zhuǎn)錄因子活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理（1）構(gòu)建一個(gè)將靶啟動(dòng)子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等（2）將要檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒，與報(bào)告基因質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子則熒光素酶基因就會(huì)表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度呈正比。（3）加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。miRNA活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理（1）構(gòu)建一個(gè)將靶3’-UTR的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列后方的報(bào)告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等（2）將要檢測(cè)的miRNA，與報(bào)告基因質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。如果此miRNA能夠抑制靶3’-UTR則熒光素酶基因表達(dá)降低，熒光素酶的表達(dá)