人工種子與脫毒

人工種子與脫毒第1頁/共59頁1人工種子

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的天然種子，一般都是由種皮、胚乳和胚三部分構(gòu)成。種皮通常在種子的外層起保護作用；胚乳含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，是種苗萌發(fā)生長不可缺少的營養(yǎng)來源；胚由胚芽、胚軸、胚根和子葉構(gòu)成，將來發(fā)成植株。

農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展，通過組織培養(yǎng)技術(shù)，可把植物組織的細(xì)胞培養(yǎng)成在形態(tài)及生理上與天然種子胚相似的胚狀體，也叫作體細(xì)胞胚。這種體細(xì)胞胚有于葉、根、莖分生組織的結(jié)構(gòu)?？茖W(xué)家把體細(xì)胞胚包埋在膠囊內(nèi)形成球狀結(jié)構(gòu)，使其具備種子機能。所以，人工種子是一種人工制造的代替天然種子的顆粒體，可以直接播種于田間。第2頁/共59頁※人工種子的概念

人工種子（artificialseeds)又稱合成種子（syntheticseeds)或體細(xì)胞種子（somaticseeds)。是將植物離體培養(yǎng)產(chǎn)生的體細(xì)胚包埋在含有營養(yǎng)成分和保護功能的物質(zhì)中，在適宜的條件下發(fā)芽出苗。人工種子的概念首先是1978年由Murashige在第四屆國際植物組織細(xì)胞培養(yǎng)大會上提出的。他認(rèn)為隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，可以用少量的外植體同步培養(yǎng)出眾多的胚狀體，這些胚狀體被包埋在某種膠囊內(nèi)使其具有種子的功能，可以直接用于田間播種。

第3頁/共59頁※人工種子的優(yōu)點1）培養(yǎng)條件可以人為控制，具有省地省工可直接在田間播種等優(yōu)點。2）在人工種子制作中，可加入營養(yǎng)物質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)劑、固氮菌、殺蟲劑等。3）用于制作人工種子的體細(xì)胞胚，可利用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)，大大提高了效率。4）一些難以得到天然種子的珍稀植物或脫毒苗、基因工程植株，均可利用人工種子技術(shù)加速用于生產(chǎn)。第4頁/共59頁以體細(xì)胞胚為繁殖體的人工種子物種主要結(jié)果胡蘿卜(Daucuscarota)有菌土壤中發(fā)芽成苗苜蓿(Medicagosativas)有菌條件下發(fā)芽成苗芹菜(Apiumgraveolens)有菌條件下發(fā)芽成苗柑橘(C.sinensis×C.reticulata)無菌條件下發(fā)芽成苗挪威云杉(Piceaabies)無菌及有菌條件下發(fā)芽松樹(Pinuslambertiana,P.aeda)無菌及有菌條件下發(fā)芽玉米(Zeamays)無菌條件下發(fā)芽成苗雜交水稻(O.sativa×O.lalifolia)無菌條件下發(fā)芽橡膠樹(Heveabrasiliensis)無菌條件下發(fā)芽西洋參(Panaxquinquefolium)無菌條件下發(fā)芽刺五加(A.senticosus)無菌及有菌條件下成苗黃連(Coptischinensis)無菌及有菌條件下成苗第5頁/共59頁以器官為繁殖體的人工種子物種繁殖體主要結(jié)果印度桑(Morusindica)芽無菌條件下發(fā)芽成苗檀香(Santalumablum)芽無菌條件下發(fā)芽成苗花葉芋(Caladiumbicolor)芽無菌條件下發(fā)芽成苗百合(Lilium)小鱗莖無菌條件下發(fā)芽成苗直桿桉樹(E.maideni)側(cè)芽無菌條件下發(fā)芽成苗萵苣(Lacyucasativa)芽無菌及有菌下發(fā)芽成苗華腺萼木(Mycetiasienensis)微芽有菌土壤中發(fā)芽成苗大花蕙蘭(Cytobium)原球莖無菌條件下發(fā)芽石槲蘭(Dendrobium)原球莖無菌條件下發(fā)芽唐菖蒲(Gladiolushortalans)球莖無菌條件下發(fā)芽香蕉(musaacuminata)微芽無菌條件下發(fā)芽楊樹(Popupusbeijingy)芽無菌條件下發(fā)芽第6頁/共59頁1.1人工種子的制作

人工種子制備包括胚狀體的誘導(dǎo)與同步化、人工種子的包埋、人工胚乳的制作、人工種皮的制作、人工種子貯藏等步驟內(nèi)容。

1.1.1胚狀體的誘導(dǎo)與同步化發(fā)育不論是哪一種方式產(chǎn)生的胚狀體，在發(fā)生和發(fā)育過程中一般是不同步的。所以在一個材料中同時可以見到各個不同發(fā)育時期的胚狀體。因此，控制胚狀體同步發(fā)育是人工種子制備的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。第7頁/共59頁

1）胚狀體的誘導(dǎo)：胚狀體可從懸浮培養(yǎng)的單細(xì)胞得到，也可通過試管培養(yǎng)的愈傷組織、花粉或胚囊獲得。胚狀體一般在培養(yǎng)物的表面產(chǎn)生，其形狀與合子胚類似，但胚狀體卻是無性繁殖的產(chǎn)物。實際操作中，一般在試管中誘導(dǎo)出愈傷組織，并在含生長素的培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，然后置于含生長素的發(fā)酵罐中，使細(xì)胞迅速擴增，再將細(xì)胞移入無生長素的發(fā)酵罐中誘導(dǎo)出大量胚狀體。2）胚狀體同步化處理或分選：胚狀體的同步化是指促使所有培養(yǎng)的細(xì)胞或發(fā)育中的細(xì)胞團塊進入同一個分裂時期。只有同步化了細(xì)胞才可能成批地產(chǎn)出成熟胚胎。常用的方法有：（1）化學(xué)方法：饑餓法——將培養(yǎng)基中的一些重要成分反復(fù)去除和添加；阻斷法——在培養(yǎng)初期加如DNA合成抑制劑，如5-氨基脲嘧啶，阻斷細(xì)胞分裂的G1期。（2）物理方法：低溫處理法、過濾篩選法、滲透壓分離法、密度梯度離心法(體胚不同的發(fā)育階段密度有差異)等到胚狀體胎成熟以后，就可以進行人工種子的包埋了。其中過濾篩選法較實用、快速。第8頁/共59頁1.1.2人工種皮制備分內(nèi)種皮和外種皮對人工種皮的要求：具有保護胚的功能，并且無毒性、通氣好、抗污染、抗壓性好、不粘連、適于貯藏和運輸。內(nèi)種皮常用材料：聚氧乙烯、海藻酸鈉、明膠、瓊脂等。第9頁/共59頁外種皮常用材料：

Elvax4260(乙烯、乙烯基乙酸和丙烯酸共聚物，1987，美國)涂膜，價高，操作復(fù)雜，效果不佳。

Tullanox和Cab-0-sil(二氧化硅化合物），以粉末狀包裹在人工種子膠囊外層，操作時只需將膠囊在材料中滾動即可。硅酮種衣，能抗真菌，滲入水蒸汽和氧氣，處于試驗之中。第10頁/共59頁1.1.3人工胚乳配制成分：無機鹽混合物、碳水化合物（糖和淀粉）、蛋白質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)劑。糖分存在容易導(dǎo)致微生物感染而腐爛，所以人工胚乳中也要加入防腐劑、抗菌素、有益菌類等。選用無毒、透氣和吸水性強的木薯淀粉與1.5%海藻酸鈉(1/2MS培養(yǎng)基配制)混合制作的胚乳可改善單一海藻酸鈉人工胚乳的透氣性、吸水性和發(fā)芽率，人工胚乳中加入（赤霉素）GA3有利于人工種子的發(fā)芽，加入CaCl2有利于向培養(yǎng)物供氧，提高人工種子發(fā)芽率和耐貯藏性，加擴活性炭可改善營養(yǎng)固定和緩釋，提高人工種子在土壤中的成苗率。

第11頁/共59頁1.1.4包埋水凝膠法

是最常用的一種方法。即用海藻酸鈉等水溶性凝膠經(jīng)與鈣離子進行離子交換后凝固，用于包埋單個胚狀體。種子硬度由凝膠濃度與絡(luò)合物離子交換時間決定。CaCl2濃度：2.0%-2.5%離子交換時間：20min-30min無菌水漂洗20min第12頁/共59頁1.2貯藏1.2.1貯藏條件：

4~7℃低溫、相對濕度小于67%1.2.2貯藏中存在的問題：種胚質(zhì)量不高、后期停止生長、胚腐爛、種子失水干縮等。1.2.3解決措施：胚乳中添加防腐劑、抗生素、控制糖含量、低溫貯藏，種皮外包裹滑石粉、液體石蠟等成分。第13頁/共59頁存在問題許多重要的植物目前還不能靠組織培養(yǎng)快速產(chǎn)生大量的、出苗整齊一致的、高質(zhì)量的體細(xì)胞胚或不定芽。包埋劑的選擇及制作工藝方面尚需改進，以提高體胚到正常植株的轉(zhuǎn)化率，并達(dá)到加工運輸方便、防干防腐耐貯藏的目的。如何進行大量制種和大田播種，實現(xiàn)機械化操作等方面配套技術(shù)尚需進一步研究。第14頁/共59頁小結(jié)人工種子是在實驗室人工控制條件下生產(chǎn)的繁殖體。人工種子繁殖體包括體細(xì)胞胚、微型器官和微芽，根據(jù)植物種類不同可適當(dāng)選擇。人工種子應(yīng)用的基本條件是繁殖體的工廠化生產(chǎn)和配套技術(shù)的成熟。無性繁殖植物的人工種子有望最先得以應(yīng)用。第15頁/共59頁2.植物脫毒

植物病毒病是作物的重要病害種類之一,目前已發(fā)現(xiàn)的植物病毒病害已超過700種,幾乎每種作物上都有一種、幾種甚至十幾種病毒危害,它們防治困難,危害嚴(yán)重,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的損失,特別是木本植物和靠營養(yǎng)繁殖的植物,危害性更大一些。在植物病毒病害防治上,植物脫毒技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。第16頁/共59頁

2.1脫毒方法

物理法：熱處理脫毒化學(xué)法：藥劑處理生物法：莖尖培養(yǎng)脫毒第17頁/共59頁第18頁/共59頁

依據(jù)病毒對高溫的敏感，寄主耐高溫。利用這一差異，選擇適當(dāng)?shù)臏囟群吞幚頃r間，進行高溫處理，就能使寄主體內(nèi)病毒濃度降低，傳遞速度減慢或失去活性，而寄主細(xì)胞仍然存活，并加快分裂和生長。熱處理區(qū)低溫高溫生長區(qū)寄主無損傷病原微生物被消除寄主被殺死BAC第19頁/共59頁2）熱處理脫毒方法(1)溫湯浸漬處理

適用于休眠器官，在50℃左右的溫水中浸漬10min至數(shù)小時，方法簡便易行，但易使材料受傷。（2）熱空氣處理

熱空氣處理對活躍生長的莖尖效果較好。將生長的盆栽植株移入溫?zé)嶂委熛鋬?nèi)，一般35-40℃。處理時間因植物而異，短則幾十分鐘，長可達(dá)數(shù)月。第20頁/共59頁

熱處理廣泛應(yīng)用于葡萄、草莓、馬鈴薯和菊花等植物。如：葡萄置于38℃可去除扇葉病毒。熱處理對葡萄扇葉病毒、草莓斑駁病毒、蘋果花葉病毒等球形病毒有作用，而對另一些病毒不起作用，因此，必須與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合脫毒效果更好。第21頁/共59頁2.1.2化學(xué)方法脫毒

又稱化學(xué)療法。一些化學(xué)藥品如嘌呤和嘧啶；類似物、氨基酸、抗生素處理，可在某種程度上抑制植物體內(nèi)或離體葉片內(nèi)病毒的合成，但仍不能是病毒失活。近年發(fā)現(xiàn)三氮唑核苷（1—β—D—呋喃核糖—1，2，4—三氮唑）用于防治一系列動物DNA和RNA病毒，對植物也有效。將感染了馬鈴薯Y型病毒（PVY）、黃瓜花葉?。–MV)或煙草花葉病毒（TMV）的葉柄，培養(yǎng)在三氮唑核苷的MS培養(yǎng)基上，子代植株則除去病毒，而對照則無效，說明三氮唑核苷抑制病毒的增殖。

第22頁/共59頁2.1.3生物法莖尖脫毒莖尖微體嫁接愈傷組織誘導(dǎo)脫毒珠心胚培養(yǎng)法花藥培養(yǎng)脫毒第23頁/共59頁（1）莖尖培養(yǎng)脫毒原理（2）培養(yǎng)基（3）莖尖培養(yǎng)方法（4）影響微莖尖培養(yǎng)的因素①外植體大?、谂囵B(yǎng)條件③外植體的生理狀態(tài)1）莖尖培養(yǎng)脫毒第24頁/共59頁

（1）莖尖培養(yǎng)脫毒原理

病毒在植物體內(nèi)分布不均勻，其數(shù)量隨植株部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域，病毒感染的程度越低，生長點即分生組織（約0.1-1mm）幾乎不含或含病毒很少。第25頁/共59頁

植物的去病毒技術(shù)，實質(zhì)上就是采取不含病毒顆粒或病毒顆粒含量甚少的0.1～0.5mm帶1～2個葉原基的莖尖作為外植體，進行微繁殖，使其培養(yǎng)成完整的無病毒小植株的技術(shù)。第26頁/共59頁

1、植物體病毒的移動的2條途徑：維管系統(tǒng)和胞間連絲。

2、植物細(xì)胞分裂和病毒繁殖之間存在相互競爭

3、莖尖中存在高水平內(nèi)源激素，可抑制病毒的增殖。

4、在植物體內(nèi)存在有一種“病毒鈍化系統(tǒng)”，在分生組織中的活性最高，因而使分生組織不受侵染。分生組織不帶病毒，可能有4方面的原因：第27頁/共59頁（2）培養(yǎng)基

一般以White、MS為基本培養(yǎng)基，提高鉀鹽和銨鹽含量有利于莖尖生長。MS培養(yǎng)某些植物莖尖時，有些離子濃度過高應(yīng)稀釋。在雙子葉植物中，激素可能在第2對葉原基中合成，所以莖尖的圓錐組織生長激素不能自給，必須加入生長素與細(xì)胞分裂素，濃度要合適。在生長素中應(yīng)避免用易促進愈傷組織化的2，4-D，宜用NAA或IBA；細(xì)胞分裂素用KT或BA；GA3對某些植物莖尖培養(yǎng)有用。第28頁/共59頁（3）莖尖的培養(yǎng)方法

需要一臺解剖鏡（8-40倍）。剝離莖尖要迅速并盡快接種，或在一個襯有無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進行操作，以防莖尖變干。

消毒：葉片包被嚴(yán)緊的芽，如菊花、蘭花，只須75%酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽，如香石竹、馬鈴薯等，則要用0.1%次氯酸鈉表面消毒10min。第29頁/共59頁莖尖長（ｍｍ）葉原基數(shù)小植株數(shù)脫毒植株數(shù)脫毒率（％）0.1215024480.272421842.90.646400離體莖尖大小對馬鈴薯脫毒效果的影響

切取莖尖越小脫毒效果越好，但太小不易成活，過大又不能保證完全出去病毒，所以莖尖大小要合適。第30頁/共59頁第31頁/共59頁TheApicalMeristem第32頁/共59頁第33頁/共59頁

剝?nèi)∏o尖過程:

解剖鏡下用解剖針將葉片剝掉，解剖針要常消毒。當(dāng)一個半圓球的頂端分生組織充分暴露出來之后，用解剖刀片將帶1-2個葉原基的分生組織切下，接到培養(yǎng)基上。

將接種的莖尖置于22℃左右溫度下。2000-3000lx16h/d光照下培養(yǎng)。由于在低溫和短日照下，莖尖有可能進入休眠；所以較高的溫度和充足的日照時間必須保證。微莖尖需數(shù)月才能成功。第34頁/共59頁

莖尖培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)和一般器官的培養(yǎng)相同。

莖尖培養(yǎng)脫毒，由于其脫毒效果好，后代穩(wěn)定，所以是目前培育無病毒苗最廣泛和最重要的一個途徑。

第35頁/共59頁（4）影響微莖尖成活及脫毒的因素首先是母體材料病毒侵染程度被單一病毒感染的植株脫毒較容易，復(fù)合感染的較難。

①外植體大小

在最適培養(yǎng)條件下，外植體的大小決定莖尖的存活率，外植體越大，產(chǎn)生再生植株的機會也就越多。除了外植體的大小之外，葉原基的存在與否也影響分生組織形成植株的能力，一般認(rèn)為，葉原基能向分生組織提供生長和分化所必需的生長素和細(xì)胞分裂素。第36頁/共59頁第37頁/共59頁第38頁/共59頁2）莖尖微體嫁接

木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根成植株，將實生苗砧木在人工培養(yǎng)基上種植培育，再從成年無病樹枝上切取0.4-1mm莖尖，在砧木上進行試管微體嫁接，以獲得無病毒幼苗。第39頁/共59頁第40頁/共59頁3）愈傷組織培養(yǎng)脫毒

愈傷組織細(xì)胞帶病原菌不均一，部分細(xì)胞不帶病毒，由這些細(xì)胞再生的植株是無病毒的。多次繼代的愈傷組織中病毒含量下降，甚至檢測不出病毒。第41頁/共59頁第42頁/共59頁4）珠心培養(yǎng)法脫毒

柑橘類多胚品種中除了一個受精胚以外，尚有多個由珠心細(xì)胞形成的無性胚，稱為珠心胚。珠心胚與維管束系統(tǒng)無聯(lián)系，因此由珠心胚產(chǎn)生的植株全部均無病毒。但珠心胚大多是不育的，必須分離培養(yǎng)才能發(fā)育成正常的幼苗。珠心胚培養(yǎng)技術(shù)對除去柑橘主要病毒，如引起銀屑病、葉脈突出病、柑橘裂皮病、柑橘速衰病等的病毒，都十分有效。第43頁/共59頁5）花藥培養(yǎng)脫毒

花藥培養(yǎng)實際上是單倍體培養(yǎng)，由此獲得單倍體植株，再通過染色體加倍獲得無病毒植株。第44頁/共59頁2.2脫毒植物的鑒定

利用生長點培養(yǎng)無毒苗的成苗率和脫毒率都非常低，有時無毒株只占千分之幾。因此，每一莖尖分化產(chǎn)生的植株，在作為母本生產(chǎn)無病毒原種以前，必須進行特定病毒鑒定。由于在培養(yǎng)的植株中許多病毒具有延遲的恢復(fù)期，所以在最初18個月中每隔一定時間仍需進行鑒定。只有病毒顯示持續(xù)陰性反應(yīng)的無病毒植株，才能進一步擴大繁殖。無病毒植株容易再被感染，因此在繁殖的不同時期仍需重復(fù)進行鑒定。常用的鑒定法有直接測定法、指示植物法、抗血清鑒定法和電子顯微鏡檢查法等。