內(nèi)皮細胞中高血糖減弱蛋白質(zhì)亞硝基化

內(nèi)皮細胞中高血糖減弱蛋白質(zhì)亞硝基化化應(yīng)激作用目標高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙是通過一氧化（的物活性和生產(chǎn)過剩的缺陷被為與糖尿病相關(guān)的血管病變最重要的事件之一是高血糖損傷機制仍未清楚我們假設(shè)，改變細胞蛋白質(zhì)亞硝基化可能導(dǎo)致高血糖從而引起內(nèi)皮功能障礙。研究設(shè)計和方法--血內(nèi)皮細胞在活性氧抑制劑存在和缺乏時對高血糖使用生物素-亞基化的蛋白質(zhì)以及與正常葡萄糖條件下培養(yǎng)的細胞相比用生物素轉(zhuǎn)化實驗檢測以分析其全部樣本的改變。我們通過蛋白質(zhì)譜分析或與特定的抗體的免疫印跡確定了內(nèi)源性的亞硝基化。結(jié)果高萄糖誘導(dǎo)顯著降低內(nèi)源性的S-亞硝基化的?蛋白質(zhì)，包括內(nèi)皮細胞一氧化合成酶、肌動蛋白、紐蛋白、甘油二酯激酶，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和錄因子核因子-B（κB趣的是，這些變化通過抑制超氧生產(chǎn)可以徹底還原，提示高血糖的件下氧化應(yīng)激調(diào)控亞硝基化起關(guān)鍵作用。此外，減少NF-κB化修飾的平行修復(fù)，通過降低阻斷超氧抑制劑使高糖誘導(dǎo)κB激恢復(fù)。結(jié)論蛋質(zhì)亞硝基化可??改變高血糖對脈管的不利影響，如基礎(chǔ)如皮功能障礙和糖尿病的進行性血管并發(fā)癥。高血糖是現(xiàn)在公認的引起的微血管和大血管病變的主要致病因素糖發(fā)的一系列相互關(guān)聯(lián)的生化反應(yīng)直接影響細胞功能導(dǎo)致異常血管重塑和發(fā)展為糖尿病并發(fā)癥功能障礙，其特征在于通過增加超氧化物生成一氧化氮（NO）生物活性的損失，它被視為是最重要的細胞事件之一，造成不良高血糖對血管的影響。NO由管內(nèi)皮細胞組成型表達，作為舉足輕重的內(nèi)皮衍生的調(diào)制器，維持正常的脈管系統(tǒng)的功能，通過其血管擴張劑血板抗增殖抗化劑和抗發(fā)炎的特性。生活性的下降，以及由此產(chǎn)生在許多疾病的血管內(nèi)皮功能障礙的生。包括高脂血癥，高血壓，代謝綜合征，糖尿病。大量的證據(jù)表明，無論是在體外還是體內(nèi)，高血糖減少內(nèi)皮NO的利用率和生物活性高糖誘導(dǎo)的NO缺乏是內(nèi)皮一氧化氮合酶）反應(yīng)產(chǎn)生的凈合成中的超氧陰離子自由基和NO的活部分原因。然而，過高糖條件下NO的生物利用度降低使下游信號事件增加很大程度上仍然未知。NO和紅素的蛋白質(zhì)（如鳥苷酸環(huán)化酶）的相互作用是相關(guān)聯(lián)的事件中最被認可的信號，亞硝基化蛋白巰基代表一個重要的附加NO依的信號機制。迄今為止亞硝基化已被確定為是具有廣泛功能的個白靶點亞基化將會導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的亞硝鎓還原產(chǎn)生半胱氨酸殘基，以調(diào)節(jié)活性的若干代謝酶，如蛋白酶、蛋白激酶磷酸酶、受體、轉(zhuǎn)錄因子以及與各種細胞骨架及結(jié)構(gòu)件。據(jù)報道種生理或病理生理條件亞硝基化的蛋白質(zhì)在血管內(nèi)皮細胞和血管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)起著重要的作用如療的促炎性細胞因子腫瘤壞死因α或氧化的氧化低密度脂蛋白）的減少導(dǎo)致內(nèi)皮蛋白質(zhì)亞硝基化。盡管當(dāng)前NO生活性降低與高血糖與糖尿病相關(guān)的血管內(nèi)皮功能障礙和血管損傷作用的分子機制仍不清楚文述了在內(nèi)皮細胞中亞基化的蛋白質(zhì)是否受高糖影響時研究了S-亞硝基化蛋白潛在調(diào)控白機制在特定環(huán)境的影響。研究設(shè)計與方法

細胞培養(yǎng)和試劑通過生物素轉(zhuǎn)化實驗檢測S-亞基化的蛋白質(zhì)S-亞基化蛋白免疫組化染色質(zhì)譜分析熒光原位DNA結(jié)測定法檢測NF-B活化統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果高糖減少了S-亞硝基化的?蛋質(zhì)在HUVECs中含量；谷胱甘肽影響高糖誘導(dǎo)蛋白質(zhì)亞硝基化的減少；高糖誘導(dǎo)減少S-亞硝基化?蛋質(zhì)；ROS抑劑可以逆轉(zhuǎn)高糖S-亞基化；高糖影響κBS-亞基化和活。討論在本研究中第次報告高糖能夠衰減在原代人類血管內(nèi)皮細胞中蛋白質(zhì)亞基化的整體水平。我們已經(jīng)確定了至少種白質(zhì)在高血糖時它們的S-硝基化的降低狀態(tài)，如圖和1所。些下降的亞硝基化蛋白可以被歸類為1）骨架蛋白（肌動蛋白，樁蛋白和波形蛋白紐蛋白謝和二?；视图っ缸樱?）信號分子H-ras和ERK-1）轉(zhuǎn)錄因子κ糖件下雖然絕大多數(shù)的S-亞硝基化的?白水平下降但是其中一些程度實際是增加或不變的示高糖在調(diào)節(jié)亞硝基化蛋白質(zhì)時扮演了一個特殊角色S-硝基化的調(diào)節(jié)牽連大量的蛋白質(zhì)活化，高血糖調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞中蛋白質(zhì)亞硝基?提了新的潛在高血糖對脈管損傷機制。100多獨立蛋白質(zhì)已被確定為S-亞基化的靶點節(jié)磺亞基化的機制仍不清楚皮胞中亞硝基化蛋質(zhì)的范圍降低促炎介質(zhì)和oxLDL和加細胞切應(yīng)力。內(nèi)皮細胞中TNF和oxLDL誘導(dǎo)超氧釋放，而切應(yīng)力增加，如超氧化物歧化酶，抗氧劑分子的表達提細胞內(nèi)谷胱甘肽NO水平降低氧化應(yīng)激任給定的靶蛋白的亞基化被認為是由形成生物相關(guān)的硝基化率和反硝基化率影響糖是已知的可以減少在細胞中的生物利用率因減少S-硝基化可能已經(jīng)造成硝基化可用有而盡管GSNO潛伏使蛋白S-亞硝基化的整體水平增，在高糖處理的細胞中亞硝基化減少，不還原GSNO潛伏后在體外控制細胞中檢測到的水平明下降的亞硝基化不僅僅是限制NO在管內(nèi)皮細胞中的利用率否提高反硝基化率的白質(zhì)亞硝基化需要進一步研究。本文報道的最重要的發(fā)現(xiàn)之一是高濃度葡萄糖對蛋白質(zhì)化修飾的抑制效果通過抑制ROS產(chǎn)被完全消除面證據(jù)表明葡糖條件下體的生產(chǎn)過剩和超氧化，通過線粒體的特殊非偶聯(lián)通從多余的糖酵解中脫離，結(jié)果使甘油-3磷脫氫酶抑制和隨后積累糖酵解中間體。據(jù)報道，抑制干N的活性氧的生產(chǎn)和利用，防止高糖誘導(dǎo)的醛糖還原酶和氨基己糖途徑的激活、蛋白激酶的活化晚期糖基化終產(chǎn)物的形成。此外，鏈脲霉素誘導(dǎo)治療糖尿病大鼠具有抗氧化作用的乙酰半胱氨酸防止內(nèi)皮依賴性舒張?zhí)悄虿∠嚓P(guān)的缺陷因此氧化應(yīng)激已經(jīng)提出了一個統(tǒng)一的機制負責(zé)啟動高血糖相關(guān)的血管內(nèi)皮功能障礙和血管損傷可影響許多信號途徑如G蛋蛋激酶離通道和轉(zhuǎn)錄因子κ。也可以增強氧化應(yīng)激干擾與NO利用率。我們發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)降低蛋白質(zhì)S-亞硝基化在細胞中治療與非特異性的抗氧化劑，包括乙酰香草酮、DPI和氧陰離子清除劑TEMPOL，或撥回抑制劑特定的境運輸CCCP或4，此前已證明內(nèi)皮細胞在高糖條件下完全阻止性氧的形成。雖然在一定程

度上觀察在些不同的活性氧的抑制圖和4）夠深入地防止高誘導(dǎo)蛋白亞硝基化的?少，這表明ROS的要作用，最近研究已證明超氧化物以劑量和時間依賴的方式誘導(dǎo)亞基硫醇分解外生的各種S-亞硝基化蛋白調(diào)節(jié)在一個單一的臨界內(nèi)的酸堿性或疏水性的結(jié)構(gòu)基序可以是受氧或依賴于谷胱甘肽修飾的半胱氨酸殘基表超氧化物可能在調(diào)控超亞基化中發(fā)揮重要作用。另一方面NO也認為調(diào)節(jié)活性硫氧還蛋白它一個重要的內(nèi)源性抗氧化劑通過Cys69上亞硝基化，是兩個重要的氣體信號通路之間的平衡連接。有趣的是等報告說也制蛋白mRNA表，硫氧還蛋白在管平滑肌細胞中的的抑制通過NO響應(yīng)順式調(diào)控TXNIP啟子的元素，通過高血糖可以終止它，這意味著憑借高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙有額外的分子機制。κB是種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能和調(diào)節(jié)各種血管疾病發(fā)病機制中的一些基因報道高血糖可以過激活蛋白激酶C和鞘氨醇激酶途徑通過量的激活NF-κB。之對應(yīng)NO是NF-κB活的有效抑制劑。有趣的是，抑制乙激酶IKK）是需要κB的活化的催化亞基已證明是亞基化直接靶點造成β活性喪失此外，κB的亞基已被報道是亞硝基化，引起結(jié)合的抑制。因此NO是能夠通過巰基亞硝基化作用于多個點沿通路減弱NF-κB信號。我們發(fā)現(xiàn)，在治療高血糖血管內(nèi)皮細胞中κB的亞基化?顯著減少，并通過制ROS的產(chǎn)生，減少被徹底扭轉(zhuǎn)。因此，高糖誘導(dǎo)的ROS抑制劑（圖4抑制κB活被阻斷。這表明κB中亞硝基化的降低在高糖條件下血管內(nèi)皮細胞中氧化應(yīng)激介導(dǎo)的κB激活中可能發(fā)揮作用?？傊咛侨菀赘緛喯趸鞍踪|(zhì)全部格局同時伴隨內(nèi)皮細胞中S-亞硝基化蛋質(zhì)的顯著減少。通過ROS抑劑可以抑制高血糖，表明化壓力可以抑制S-亞硝基化或加速非亞硝基化雖改變S-亞基化蛋白質(zhì)的具體功能直接后果有待確定是亞硝基化的改變可能會導(dǎo)致高血糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙及血管病變現(xiàn)可能產(chǎn)生一種新的方法和預(yù)防戰(zhàn)略來設(shè)計治療糖尿病相關(guān)的心血管疾病。圖HUVECs中血糖對S-基亞硝基化蛋白質(zhì)?影響用NG30mmol/l（）葡萄糖處理3天A：在實驗方案和設(shè)計中描述全細胞裂解物進行生物素化實驗。通過和抗生物素抗體免疫印跡分離S-亞基化蛋白。并用底部疫印跡進行全細胞裂解液分析和用抗粘著斑蛋白抗體表示同等級別的蛋白梯度。B處理過的細胞進行固定和抗亞硝基半胱氨酸抗體作為免疫染色至少三個獨立實驗和不同HUVECs株出現(xiàn)相近數(shù)據(jù)結(jié)果實驗。圖2蛋質(zhì)亞基化中谷胱甘肽的影響。圖描了HUVECs中的溶解產(chǎn)物的治療。100mmol/l或在暗中室溫下培養(yǎng)20分然進行生物素轉(zhuǎn)化實驗亞基化蛋白通過抗生物素抗體免疫印跡分離。底部免疫印跡進行全細胞裂解液分析和用抗粘著斑蛋白抗體表明蛋白度的相同水平經(jīng)典印至少有三個獨立實驗與不同HUVEC株。圖HUVECs中S-亞硝基ROS抑制劑的影響。和B過3天潛期常）和高糖（）用DPI（）或L的CCCP，10mol/lTTFA或-OHCA（）治療16小時，細胞溶解產(chǎn)物進行生物素轉(zhuǎn)化實驗法、免疫印跡分析和抗生物素抗體實驗。抗波形蛋白抗體用于控制梯度。至少用三個獨立的實驗與不HUVEC株進行實驗，數(shù)結(jié)果相似。圖高在S-亞基化和活化的κB中的影響。A的響源于HUVECs胞溶解產(chǎn)物經(jīng)正常（NG）或高葡萄糖）理后用或培養(yǎng)3天然后進行生素轉(zhuǎn)化實驗鏈霉親和素-瓊糖純化的亞硝基化?蛋質(zhì)與20μl細溶解產(chǎn)物通過SDS

和免疫印跡抗κB抗體分離解的免疫印兩道NF-B表相同水平。B：與或培養(yǎng)天并500nmol/lCCCP、10mol/lTTFA或4-OHCA16小治療，κBS-亞硝基化水平由生物素轉(zhuǎn)化檢測。用三個獨立的實與不HUVEC株行實驗三次獨立實驗的代表在不同的