苦丁茶冬青及其近緣種的研究與種質(zhì)資源評價

苦丁茶冬青其近緣種的究與種質(zhì)資評價“苦丁茶是中國民間一大類代茶飲料植物的總稱中有兩類丁茶”在國內(nèi)外比較有影響：一類是以苦丁茶冬青kudingcha為代表的冬青科苦丁茶；另一類是以粗壯女貞Ligustrumrobustum為代表的木犀科苦丁茶。本研究僅限于研究冬青科苦丁茶。冬青科苦丁茶包含苦丁茶冬青kudingcha葉冬青棱苦丁茶骨I.cornuta、華中枸骨I.centrochinensis、霍山冬青I.huoshanensis等136冬青屬植物。在6種植物當(dāng)中,栽培面積、產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)價值等方面最具影響者系苦丁茶冬青。影響冬青屬苦丁茶植物產(chǎn)業(yè)發(fā)展和推廣的因素較多其中植物基源和種質(zhì)資源品質(zhì)是兩大關(guān)鍵因素。由于傳統(tǒng)上冬青屬植物歸屬于分類較為困難的群體之一在植物系統(tǒng)學(xué)上表現(xiàn)為分類學(xué)者對是否應(yīng)將苦丁茶冬青與扣樹以及霍山冬青與華中枸骨給予合并存在著爭議。此外,海南大學(xué)苦丁茶研究所還發(fā)現(xiàn)了存在系統(tǒng)位置不明的冬青屬苦丁茶種質(zhì)材料,其形態(tài)特征介于苦丁茶冬青和五棱苦丁茶之間。這些系統(tǒng)學(xué)難題給冬青科苦丁茶的可持續(xù)發(fā)展帶來了嚴(yán)重的負(fù)面影響研究從植物形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、微形態(tài)學(xué)、核型特征、數(shù)量分類學(xué)、化學(xué)分類學(xué)、紅外光譜分析子生物學(xué)等角度對苦丁茶冬青及其近緣種的系統(tǒng)學(xué)進(jìn)行比較系統(tǒng)的和綜合研究,以期為解決冬青屬苦丁茶系統(tǒng)學(xué)的難題提供科學(xué)依據(jù)。此外,作者還以綠原酸和蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)利用反相高效液相色譜和超聲提取等方法對苦丁茶冬青及其近緣種的種質(zhì)資源進(jìn)行科學(xué)評價為其資源開發(fā)和利用提供理論支撐本研究取得的主要成果如下1.對6種冬青屬苦丁茶植物形態(tài)進(jìn)行

了觀察和比較,結(jié)果顯示,本研究的物種莖的形態(tài)有五棱形和圓形兩類?？喽〔瓒嗟幕ū换鶖?shù)子房室數(shù)目果實分核數(shù)目和花的性別特征均存在豐富的多樣性述特征對于冬青屬苦丁茶植物的分類鑒定和遺傳多樣性的研究具有一定的輔助意義。通過實地觀測,結(jié)果表明,除五棱苦丁茶的植物莖為五棱形外,其余5種植物的莖均為圓形。苦丁茶冬青的花被數(shù)、子房室數(shù)目、果實分核數(shù)目以4為主；在性別方面,以單性花為主,但也存在雜性的現(xiàn)象。2.對6種冬青屬苦丁茶植物莖和葉柄的解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察和比較果顯示,本研究的物種之間其莖的結(jié)構(gòu)大體相似,差異體現(xiàn)在髓部形態(tài)部與次生維管束寬度比例、木射線的寬度及密度方面。該6種冬青屬植物葉柄解剖結(jié)構(gòu)也大體相似其主要差異體現(xiàn)在維管束的形態(tài)方面,可分為兩大類。利用熒光顯微鏡觀察了莖和葉柄的解剖結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,霍山冬青莖中髓部寬度所占比例最大；枸骨和華中枸骨莖的髓部形態(tài)呈四方形,其他四種莖的髓部形態(tài)呈圓形或近圓形；木射線最寬的是苦丁茶冬青,大葉冬青和五棱苦丁茶的木射線寬度次之；葉柄木質(zhì)部束呈較規(guī)則半月形者為枸骨、華中枸骨、霍山冬青和大葉冬青典型不規(guī)則半月形者為苦丁茶冬青和五棱苦丁茶3.6冬青屬苦丁茶植物的莖葉形態(tài)數(shù)量分類學(xué)研究結(jié)果與葉柄解剖分類結(jié)果相似,均可分為同樣的兩大類。基于26個莖葉形態(tài)變量的數(shù)量聚類分析結(jié)果,可6種冬青屬苦丁茶植物分為兩大類,第一類為苦丁茶冬青和五棱苦丁茶；第二類為大葉冬青、霍山冬青、枸骨和華中枸骨4種植物成分分析結(jié)果表明第一主成分主要反映的是葉片對稱性、葉柄長度、葉基到最寬處的距離與葉長的比值。

4.葉表皮微形態(tài)特征研究結(jié)果表明冬青屬苦丁茶葉片微形態(tài)特征具有種級水平上的分類學(xué)意義,可以為苦丁茶冬青及其近緣種的劃分提供可靠的依據(jù)。根據(jù)葉表皮微形態(tài)特征的研究結(jié)果,不支持霍山冬青與華中枸骨的合并。結(jié)合分子生物學(xué)證據(jù)與葉表皮特征微形態(tài)特征的研究結(jié)果形態(tài)居間種質(zhì)材料的冬青屬苦丁茶類型應(yīng)為五棱苦丁茶(Lpentagona)變種學(xué)顯微鏡和掃描電鏡研究結(jié)果表明,7種冬青屬苦丁茶植物的葉表皮微形態(tài)特征具有一定的相似性,如氣孔器均位于下表皮,每種植物均有正常氣孔器和大氣孔器,氣孔器類型以環(huán)列型為主,其次為雙環(huán)列型；其差異性體現(xiàn)在葉表皮細(xì)胞的垂周壁形態(tài)和氣孔外緣角質(zhì)層紋飾等方面?；羯蕉嗳~表皮微形態(tài)與華中枸骨存在著較大區(qū)別觀察了不同地域的枸骨和四種性別特征材料的苦丁茶冬青的正常與異?；ㄋ幣c花粉的微形態(tài)學(xué)特征同時還研究了大葉冬青、貢山冬青和貓兒刺的花粉特征。研究結(jié)果表明,花藥紋飾大體相似,但花粉外壁紋飾和萌發(fā)溝粉體積在種間和種內(nèi)具有較大差異育或敗育花粉則在萌發(fā)溝深度和長度方面與正常花粉具有較大差異。根據(jù)花藥與花粉微形態(tài)學(xué)研究結(jié)果說明花藥特征對冬青屬系統(tǒng)分類意義不大,但花粉的特征對于冬青屬植物的分類具有一定的價值。掃描電鏡研究結(jié)果表明,所研究的五類材料其花藥紋飾大體相似,具有不規(guī)則脊紋并間有條紋,種間區(qū)別不顯著；花粉均為三溝型,外壁紋飾均具疣狀或釘狀顆粒。不同物種間同地域的枸骨與不同性別特征的苦丁茶冬青其花粉體積大小指數(shù)紋飾顆粒密度萌發(fā)溝長度和寬度及其比值等特征都具有多樣性此外不育或敗育花粉微形態(tài)體現(xiàn)在萌發(fā)溝深淺和長度不一具有一定的生態(tài)學(xué)意義。

6.染色體核型分析結(jié)果表明,4種冬青屬苦丁茶的核型可分為兩類,核型分析的研究結(jié)果有助于研究冬青屬植物的親緣關(guān)系過酶解離染色后顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)苦丁茶冬青葉冬青和形態(tài)居間類型種質(zhì)材料其核型屬于類型,五棱苦丁茶屬于3B類型。就核型分析結(jié)果而言,形態(tài)居間類型種質(zhì)材料的核型更接近于苦丁茶冬青。7.冬青屬苦丁茶化學(xué)分類學(xué)聚類分析研究結(jié)果顯示五棱苦丁茶與苦丁茶冬青歸為一類,這表明化學(xué)分類學(xué)與形態(tài)數(shù)量分類學(xué)研究結(jié)果基本一致；同時也顯示苦丁茶冬青在化學(xué)成分方面具有一定的多樣性這種多樣性與其分布地域有關(guān)。根據(jù)RP-HPLC數(shù)據(jù)和軟件進(jìn)行了化學(xué)分類學(xué)研究種冬青屬植物中色譜峰共有峰數(shù)目有6個,另外在各個物種色譜圖中作者還發(fā)現(xiàn)了一些特殊峰。根據(jù)聚類分析的結(jié)果,五棱苦丁茶(S12,S13)與苦丁茶冬青(S2)種質(zhì)材料聚類在一起,其親緣關(guān)系最近,但起源于廣西馬山石灰?guī)r地區(qū)的苦丁茶冬青(S1)種質(zhì)材料單獨(dú)聚為1類,其所含有的化學(xué)成分種類及含量與其他地域苦丁茶冬青的差異很大。8.六種冬青屬苦丁茶的葉片因種質(zhì)材料的起源地域野生來源與栽培條件以及葉片儲藏措施的不同,其綠原酸含量存在明顯差異?；诔曁崛『突A(chǔ)上的綠原酸含量研究結(jié)果表明,新采集的成熟功能葉經(jīng)過低溫干燥后,其所含綠原酸含量由大到小依次為丁茶冬青>霍山冬青>大葉冬青>五棱苦丁茶>華中枸骨gt;枸骨燥的成熟功能葉放置2月后綠原酸含量顯著降低；在苦丁茶冬青野生材料不同發(fā)育階段的葉片中大部分材料以老葉綠原酸含量最高；一般來說苦丁茶冬青野生材料葉片中綠原酸含量要高于栽培材料,種間或種內(nèi)綠原酸含量存在較大的差異,這可能與種質(zhì)材料的起源地域有關(guān)。9.根據(jù)葉總黃酮含量測定結(jié)果并結(jié)合綠原酸含量的分析結(jié)

果,可以認(rèn)為霍山冬青是一種良好的苦丁茶種質(zhì)資源；利用幼嫩葉加工成苦丁茶具有其科學(xué)性。在超聲提取、絡(luò)合反應(yīng)及紫外分光光度法,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)的含量測定結(jié)果表明,就5批次栽培材料的功能葉總黃酮的平均值而言苦丁茶冬青(3.96%)>五棱苦丁茶(3.67%)>霍山冬青(3.63%)>骨(3.04%)>大葉冬青2.64%)；低溫干燥(50℃)放置2月后的葉片總黃酮含量明顯降低培條件下的苦丁茶冬青,其成熟葉片中的總黃酮含量平均值要高于野生植株成熟功能葉所含量；就所有個體總黃酮含量而言,霍山冬青最高(7.39%)嫩葉的總黃酮含量具有較高的水平基于紅外光譜分析的研究表明利用紅外二階導(dǎo)數(shù)譜圖可以將不同物種的冬青屬苦丁茶植物和不同來源的苦丁茶冬青種質(zhì)材料快速和有效地加以區(qū)分。一維傅里葉中紅外光譜分析表明不同物種的冬青屬苦丁茶植物和不同來源的苦丁茶冬青種質(zhì)材料不易區(qū)分,有大量的共同的吸收峰特征峰相對較少過對指紋區(qū)二階導(dǎo)數(shù)圖譜變換,將重疊的光譜分開后除共同的吸收峰外,不同物種的冬青屬苦丁茶植物和不同來源的苦丁茶冬青種質(zhì)材料葉片紅外光譜圖吸收峰位置、數(shù)目和吸光度顯示出了明顯差異,利用此差異可以對上述物種或不同來源的種質(zhì)材料進(jìn)行鑒別。利用紅外光譜聚類分析表明,形態(tài)居間類型種質(zhì)材料與五棱苦丁茶親緣關(guān)系較近,霍山冬青與華中枸骨親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)?；赟RAP-PCR分子標(biāo)記的聚類分析結(jié)果表明,供試的6種冬青屬苦丁茶可分為兩大類與其他分子標(biāo)記的實驗結(jié)果基本一致。同時SRAP分子標(biāo)記實驗結(jié)果還顯示供試的苦丁茶冬青不同的種質(zhì)材料可分為兩大類這己研究結(jié)果為探討苦丁茶冬青的基因型分類提供了可靠的科學(xué)證據(jù)。

在本研究中,苦丁茶冬青五棱苦丁茶和大葉冬青聚為一大類枸骨華中枸骨和霍山冬青聚為一大類,這與傳統(tǒng)的根據(jù)其葉形的分類結(jié)果完全一致。也與其他分子標(biāo)