發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)的臨床應(yīng)用

發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)的臨床應(yīng)用第1頁(yè)/共89頁(yè)由于化學(xué)反應(yīng)（通常是氧化）產(chǎn)生電子能級(jí)處于激發(fā)態(tài)的物質(zhì)，后者通過(guò)躍遷釋放能量產(chǎn)生光子，從而導(dǎo)致的發(fā)光現(xiàn)象?；瘜W(xué)發(fā)光

（Chemiluminescence）生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光均屬于冷光，即發(fā)光不是由于發(fā)光體溫度升高所至，發(fā)射波長(zhǎng)也與其溫度無(wú)關(guān)第2頁(yè)/共89頁(yè)按化學(xué)反應(yīng)類型化學(xué)發(fā)光的分類酶促化學(xué)發(fā)光：辣根過(guò)氧化物酶系統(tǒng)堿性磷酸酶系統(tǒng)黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)非酶促化學(xué)發(fā)光：

吖啶酯系統(tǒng)草酸酯系統(tǒng)三價(jià)鐵-魯米諾系統(tǒng)閃光（Flash）:按發(fā)光持續(xù)時(shí)間發(fā)光時(shí)間在數(shù)十分鐘以上，如：

HRP-Luminol系統(tǒng)

AP-AMPPD系統(tǒng)黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)無(wú)須原位進(jìn)樣、以速率法測(cè)量。發(fā)光時(shí)間在數(shù)秒內(nèi)，如吖啶酯以原位進(jìn)樣(InSituInjector)和時(shí)間積分法測(cè)量輝光（Glow）:第3頁(yè)/共89頁(yè)時(shí)間發(fā)光信號(hào)輝光坪區(qū)速率法測(cè)量原位進(jìn)樣積分法測(cè)量閃光尖峰閃光與輝光及其測(cè)量方式的差別第4頁(yè)/共89頁(yè)

魯米諾及其衍生物的增敏化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)H2O2+NH2OONHNHN2OH-HRPNH2CO2-CO2-+Photon(425nm)ROHROHNSRBOHOH增強(qiáng)劑（Enhancer）商業(yè)化產(chǎn)品中常見(jiàn)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)第5頁(yè)/共89頁(yè)AMPPD及其衍生物的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)+*光子(477nm)APOOOCH3OPO32-O-OOOCH3OO-OOCH3商業(yè)化產(chǎn)品中常見(jiàn)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)第6頁(yè)/共89頁(yè)CH3C=OORN+OH-H+H2O2+H2O+ROH光子+CO2+CH3C=OORNHOCH3C=OORNHOOCH3ONCH3ONC=OO商業(yè)化產(chǎn)品中常見(jiàn)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)吖啶酯化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)第7頁(yè)/共89頁(yè)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)光敏二極管、光敏電池、光電偶合器（CCD）結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定但靈敏度低、線性范圍較窄。主要特點(diǎn)原理光信號(hào)光電轉(zhuǎn)換器件電壓或電流信號(hào)放大第8頁(yè)/共89頁(yè)單光子計(jì)數(shù)器是目前高靈敏度發(fā)光分析儀的核心部件光電倍增管高壓高速放大器高速比較器高速分頻器發(fā)光樣品產(chǎn)生光子激發(fā)光陰極產(chǎn)生光電子在陽(yáng)極上形成較強(qiáng)信號(hào)脈沖信號(hào)相對(duì)發(fā)光單位數(shù)字脈沖(RLU)在各打拿極之間得到能量和數(shù)目的倍增第9頁(yè)/共89頁(yè)單光子計(jì)數(shù)式發(fā)光檢測(cè)儀計(jì)算機(jī)打印機(jī)發(fā)光儀控制模塊發(fā)光儀執(zhí)行模塊控制器程控高壓計(jì)數(shù)/貯存器單光子計(jì)數(shù)器樣品運(yùn)動(dòng)/定位裝置程控自動(dòng)門鎖及檢測(cè)裝置原位注射泵第10頁(yè)/共89頁(yè)光生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用范圍軍事偵測(cè)公安稽查衛(wèi)生檢疫藥物篩查醫(yī)學(xué)診斷環(huán)境檢測(cè)航天遙感生命科學(xué)……

已成為現(xiàn)代生物技術(shù)最活躍的領(lǐng)域之一第11頁(yè)/共89頁(yè)光生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)越性徹底消除了放射性危害無(wú)半衰期限制，試劑穩(wěn)定性和有效期大大延長(zhǎng)容易實(shí)現(xiàn)連續(xù)、動(dòng)態(tài)、重復(fù)測(cè)定適合于復(fù)合標(biāo)記系統(tǒng)進(jìn)行多指標(biāo)并行測(cè)定操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)速度快，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化靈敏度和線性范圍超過(guò)以往技術(shù)第12頁(yè)/共89頁(yè)幾種標(biāo)記/檢測(cè)技術(shù)靈敏度的比較酶標(biāo)熒光放免發(fā)光靈敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9第13頁(yè)/共89頁(yè)幾種標(biāo)記/檢測(cè)技術(shù)線性范圍的比較酶標(biāo)熒光放免發(fā)光線性范圍105104103102第14頁(yè)/共89頁(yè)幾種標(biāo)記/檢測(cè)試劑的有效期比較酶標(biāo)熒光放免發(fā)光有效期（月）1815129630第15頁(yè)/共89頁(yè)020,00040,00060,00080,000100,000試劑盒儀器特殊防護(hù)治理污染人民幣人民幣三種免疫測(cè)定技術(shù)的成本及費(fèi)用三種免疫測(cè)定技術(shù)的成本及費(fèi)用放免酶標(biāo)發(fā)光第16頁(yè)/共89頁(yè)抗原：可誘導(dǎo)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)。抗體：由動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，可特異性結(jié)合某種物質(zhì)的球蛋白。免疫分析技術(shù)基本原理利用抗原、抗體之間的特異性結(jié)合來(lái)測(cè)定、分析特定物質(zhì)的方法第17頁(yè)/共89頁(yè)免疫測(cè)定技術(shù)分類反應(yīng)結(jié)束后是否需要分離均相法（Homogeneous）非均相法（Heterogeneous）第18頁(yè)/共89頁(yè)均相法（Homogeneous）免疫凝集法：自然凝集：血型測(cè)定肥達(dá)氏反應(yīng)；敏化凝集：血球凝集法凝膠（微粒）比濁法免疫擴(kuò)散法；免疫電泳法近場(chǎng)液閃法，酶--輔酶（亞基）配位法熒光偏振法，熒光共振法吖啶酯水解法，生物傳感器第19頁(yè)/共89頁(yè)非均相法（Heterogeneous）免疫印跡（Western-blot）：基因表達(dá)分析、HIV感染確認(rèn)實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)技術(shù)：原位基因表達(dá)分析、臨床病理學(xué)分析紙片法：早孕快速檢測(cè)、吸毒檢測(cè)快速、獻(xiàn)血快速檢測(cè)放射免疫法（RIA）：沉降法（放免）、固相法（免放，IRMA）熒光免疫法（FIA）；酶聯(lián)免疫法（EIA，ELISA）酶聯(lián)熒光法（FEIA）、化學(xué)發(fā)光法（LIA）酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光法（ELIA）、時(shí)間分辨熒光法（DELFIA）、電化學(xué)發(fā)光法（ECLIA）；……第20頁(yè)/共89頁(yè)雙抗體夾心法（三明志法）原理固相支持物表面包被抗體標(biāo)記抗體待測(cè)物第21頁(yè)/共89頁(yè)夾心法的劑量--反應(yīng)關(guān)系曲線信號(hào)強(qiáng)度（Y）線性范圍待測(cè)物濃度（X）Hook(前滯)效應(yīng)分析靈敏度（最低檢測(cè)限）（95%可信度）：

S0+2SD在該曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度值。功能靈敏度：測(cè)定誤差（變異）≤20%的最低可檢測(cè)濃度。線性范圍：（分析）功能靈敏度---變異≤20%的最高檢測(cè)濃度相關(guān)系數(shù)≥0.99的曲線范圍第22頁(yè)/共89頁(yè)競(jìng)爭(zhēng)法的原理固相支持物表面待測(cè)物包被抗體標(biāo)記抗原第23頁(yè)/共89頁(yè)競(jìng)爭(zhēng)法的劑量--反應(yīng)關(guān)系曲線待測(cè)物濃度（X）信號(hào)強(qiáng)度（Y）線性范圍分析靈敏度（最低檢測(cè)限）（95%可信度）：

S0-2SD在該曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度值功能靈敏度：測(cè)定誤差（變異）≤20%的最低可檢測(cè)濃度線性范圍：

（分析）功能靈敏度---變異≤20%的最高檢測(cè)濃度相關(guān)系數(shù)≥0.99的曲線范圍第24頁(yè)/共89頁(yè)間接法原理包被體待測(cè)抗體包被抗原標(biāo)記抗體（二抗）第25頁(yè)/共89頁(yè)俘獲法原理俘獲抗體（二抗）待測(cè)抗體標(biāo)記抗原包被體第26頁(yè)/共89頁(yè)雙抗原夾心法原理包被體待測(cè)抗體包被抗原標(biāo)記抗原第27頁(yè)/共89頁(yè)間接包被夾心法原理包被體待測(cè)抗原包被連接物標(biāo)記抗體俘獲抗體特點(diǎn)：所有試劑盒均采用同一包被物和包被工藝第28頁(yè)/共89頁(yè)發(fā)光免疫分析基本操作步驟（一步法）待測(cè)樣品標(biāo)記抗體或抗原洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物發(fā)光底物儀器檢測(cè)包被抗體或抗原的反應(yīng)管反應(yīng)30-60分鐘反應(yīng)0-5分鐘第29頁(yè)/共89頁(yè)發(fā)光免疫分析基本操作步驟（二步法）待測(cè)樣品洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物發(fā)光底物儀器檢測(cè)包被抗體或抗原的反應(yīng)管反應(yīng)30-60分鐘反應(yīng)0-5分鐘標(biāo)記抗體或抗原洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物反應(yīng)30-60分鐘第30頁(yè)/共89頁(yè)發(fā)光免疫分析技術(shù)的現(xiàn)狀及應(yīng)注意的問(wèn)題第31頁(yè)/共89頁(yè)目前已商品化的光生物學(xué)標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)整體性能比較技術(shù)類型標(biāo)記、反應(yīng)體系主要優(yōu)點(diǎn)主要不足化學(xué)發(fā)光酶促過(guò)氧化物酶、魯米諾、氧化劑、增強(qiáng)劑等測(cè)量方式簡(jiǎn)單（速率法）成本較低、靈敏度較高工作曲線隨時(shí)間漂移低端斜率呈非線性下移螺旋金剛烷環(huán)氧化物、堿性磷酸酶測(cè)量方式簡(jiǎn)單（速率法）靈敏度較高非酶促吖啶酯、過(guò)氧化氫靈敏度較高試劑成本高、發(fā)光時(shí)間短測(cè)量方式復(fù)雜（積分法）需原位進(jìn)樣(InSituInjector)儀器成本及維護(hù)費(fèi)用較高試劑成本較高時(shí)間分辨熒光銪（Eu）、鏑(Dy)、釤（Sm）、鋱（Tb）、等絡(luò)合物脈沖光源激發(fā)靈敏度較高、試劑較穩(wěn)定測(cè)量方式復(fù)雜（脈沖激發(fā)、間歇式測(cè)量、流動(dòng)池）儀器成本及維護(hù)費(fèi)用高環(huán)境及樣品中同類元素可導(dǎo)致本底干擾電化學(xué)發(fā)光釕(Ru)的絡(luò)合物脈沖電場(chǎng)激發(fā)時(shí)間分辨熒光（也稱時(shí)間延遲光致發(fā)光）：TimeResolvedFluorescence

（TimeDelayedPhotoluminescence）解離增強(qiáng)熒光免疫分析（DEFIA）電化學(xué)發(fā)光（也稱場(chǎng)致發(fā)光）：Electrochemiluminescence（Electroluminescence）化學(xué)發(fā)光：Chemiluminescence第32頁(yè)/共89頁(yè)例如：電化學(xué)發(fā)光TSH檢測(cè)試劑的分析靈敏度為0.005mIU/L

第四代化學(xué)發(fā)光TSH檢測(cè)試劑的分析靈敏度為0.001mIU/L

原因在于抗體的親合力，而不是檢測(cè)技術(shù)。篩選抗體、屏蔽干擾，生產(chǎn)工藝、管理水平和技術(shù)服務(wù)是試劑生產(chǎn)的關(guān)鍵這些發(fā)光檢測(cè)技術(shù)的靈敏度及線性范圍都已經(jīng)接近了免疫反應(yīng)的極限。靈敏度的瓶頸在于抗體親合力和干擾免疫反應(yīng)的因素，而不是檢測(cè)技術(shù)。片面宣揚(yáng)檢測(cè)技術(shù)靈敏度和線性范圍的強(qiáng)弱，不僅毫無(wú)意義，而且也是荒謬的。第33頁(yè)/共89頁(yè)發(fā)光技術(shù)——臨床免疫分析劃時(shí)代的進(jìn)步以TSH(促甲狀腺素)為例第一代TSH檢測(cè)試劑盒普通放免功能靈敏度1-2mIU/L基本無(wú)法測(cè)到正常值下限以下的血清TSH濃度對(duì)甲亢的診斷意義不大固相放免功能靈敏度0.1-0.2mIU/L在甲亢的診斷中開始發(fā)揮作用第二代TSH檢測(cè)試劑盒發(fā)光免疫功能靈敏度0.01-0.02mIU/L成為甲亢診斷的首選指標(biāo)之一發(fā)光免疫功能靈敏度0.001-0.002mIU/L一系列新的臨床現(xiàn)象改寫了垂體甲狀腺軸的調(diào)控狀態(tài)第三代TSH檢測(cè)試劑盒第四代TSH檢測(cè)試劑盒第34頁(yè)/共89頁(yè)目前商品化發(fā)光免疫分析產(chǎn)品的幾個(gè)特點(diǎn)大多采用全自動(dòng)工作方式，部分采用微孔板半自動(dòng)方式多數(shù)采用磁性或非磁性微粒包被，以增加表面積，使靈敏度進(jìn)一步提高，反應(yīng)時(shí)間大大縮短使用內(nèi)建標(biāo)準(zhǔn)曲線加校正的辦法產(chǎn)生工作曲線部分產(chǎn)品采用流動(dòng)池測(cè)定方式(適合于閃光型發(fā)光或電化學(xué)發(fā)光)第35頁(yè)/共89頁(yè)流動(dòng)池檢測(cè)方式示意圖檢測(cè)器檢測(cè)池負(fù)壓泵廢液四通閥沖洗液樣品管計(jì)量泵干燥空氣原位進(jìn)樣泵氧化劑第36頁(yè)/共89頁(yè)使用商品化發(fā)光免疫分析產(chǎn)品可能遇到的幾個(gè)問(wèn)題與以往方法（放免等）在檢測(cè)指標(biāo)的正常值及臨床意義上的差異。如：免疫源性胰島素與真胰島素、HCG、性激素等采用不同的單抗或多抗時(shí)檢測(cè)結(jié)果也有較大差異。（單抗特異性好，受干擾小，因此測(cè)值低）不同廠家產(chǎn)品測(cè)定結(jié)果之間一致性差（未與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)）。所使用的內(nèi)建標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合校正的方法不盡完善。部分產(chǎn)品不顯示原始數(shù)據(jù)，無(wú)法監(jiān)控其準(zhǔn)確性。第37頁(yè)/共89頁(yè)免疫分析結(jié)果的干擾因素溫度氧化劑還原劑光線磁場(chǎng)金屬離子防腐劑雜質(zhì)本底物質(zhì)第38頁(yè)/共89頁(yè)同一干擾因素對(duì)不同檢測(cè)方法的不同影響待測(cè)物包被（結(jié)合）抗體放免法免放或發(fā)光法標(biāo)記抗原TBG離心沉降洗滌祛除以甲狀腺素結(jié)合蛋白（TBG）干擾競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定T3為例信號(hào)↑結(jié)果↓信號(hào)↓結(jié)果↑第39頁(yè)/共89頁(yè)使用商品化發(fā)光免疫分析產(chǎn)品必須做好的幾個(gè)工作在廠家提供的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，自行建立正常參考值系統(tǒng)。明確各個(gè)試劑盒的特異性及交叉反應(yīng)情況如：小分子激素之間，以及與自身前體或代謝物之間的交叉胰島素與C-肽、胰島素原之間的交叉

FSH、LH、HCG之間的交叉。充分利用現(xiàn)有國(guó)標(biāo)參考品校正結(jié)果（注意防腐劑干擾）（可以從國(guó)家藥品生物制品檢定所或臨床檢驗(yàn)中心得到）自行建立多點(diǎn)質(zhì)控（2-3點(diǎn)）監(jiān)控每次實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。盡可能避免干擾因素采樣：清潔樣品管（防止還原劑干擾）、不使用酶抑制劑、及時(shí)送檢實(shí)驗(yàn)室：恒溫、避免強(qiáng)光和強(qiáng)磁場(chǎng)、嚴(yán)格操作規(guī)程、及時(shí)維護(hù)、報(bào)修第40頁(yè)/共89頁(yè)正常值參考的意義及灰色區(qū)域的存在如果測(cè)定結(jié)果處于灰色區(qū)域（約在正常值上下限以內(nèi)20%）內(nèi)，則需要進(jìn)一步追蹤檢查。95%或99%-20%+20%第41頁(yè)/共89頁(yè)自身基礎(chǔ)數(shù)據(jù)——最佳“正常參考值”對(duì)于患者來(lái)講，最佳的參考值是自己以往的測(cè)定數(shù)據(jù)，即自身對(duì)照；因此積累病人的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)非常重要。尤其是性激素、生長(zhǎng)激素、胰島素等具有周期性分泌或釋放規(guī)律的激素。時(shí)間FSH卵泡期排卵期黃體期月經(jīng)期正常人平均值變化規(guī)律正常參考值范圍某一患者變化規(guī)律（無(wú)排卵峰）第42頁(yè)/共89頁(yè)保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的對(duì)該檢驗(yàn)項(xiàng)目或其檢驗(yàn)結(jié)果普遍意義的解釋不要試圖替臨床大夫?yàn)槟骋痪唧w病例作出最終診斷建立和完善實(shí)驗(yàn)室面向臨床大夫乃至患者的咨詢制度檢驗(yàn)醫(yī)師必須牢記檢驗(yàn)醫(yī)師給臨床所提供的一切服務(wù)僅限于第43頁(yè)/共89頁(yè)化驗(yàn)結(jié)果與臨床不符的原因由于個(gè)體差異或不明干擾因素的存在，總有少數(shù)病例的化驗(yàn)結(jié)果與其臨床表現(xiàn)不符操作失誤、儀器故障、試劑失活等因素某些夾心一步法試劑往往存在前滯效應(yīng)藥物以及其它基礎(chǔ)疾病的干擾排除這些因素后重復(fù)測(cè)定或重復(fù)送樣用同試劑盒的校準(zhǔn)品A稀釋后再重新測(cè)定及時(shí)與臨床溝通結(jié)合說(shuō)明書綜合判斷原因解決第44頁(yè)/共89頁(yè)不同實(shí)驗(yàn)方法，或同一方法的不同廠家產(chǎn)品之間，其測(cè)定結(jié)果和臨床正常值都會(huì)有所差異不同實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和不同人群條件下，其測(cè)定結(jié)果和臨床正常值也會(huì)有所不同在廠家提供的正常參考值基礎(chǔ)上建立自己的正常參考系統(tǒng)待測(cè)物質(zhì)的降解及其與血清蛋白結(jié)合狀態(tài)的改變，某些化驗(yàn)項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果往往受標(biāo)本存放時(shí)間及其貯存條件的影響及時(shí)采樣、送檢，實(shí)驗(yàn)室及時(shí)完成化驗(yàn)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書要求存放第45頁(yè)/共89頁(yè)常見(jiàn)臨床免疫檢測(cè)指標(biāo)的意義及其限制因素第46頁(yè)/共89頁(yè)激素類型氨基酸：甲狀腺激素蛋白（肽）：甲狀旁腺激素、下丘腦激素、垂體激素、降鈣素、胎盤激素、心肌激素、胃腸激素類固醇：性激素和皮質(zhì)激素兒茶酚胺：腎上腺素下丘腦-垂體-內(nèi)分泌軸及其調(diào)節(jié)關(guān)系長(zhǎng)反饋：垂體或下丘腦激素受靶細(xì)胞分泌激素的反饋調(diào)節(jié)，以負(fù)反饋為主，但排卵時(shí)雌激素為正反饋。短反饋：垂體激素對(duì)于下丘腦的反饋負(fù)反饋超短反饋：下丘或垂體激素直接負(fù)反饋?zhàn)陨淼暮铣珊头置诘?7頁(yè)/共89頁(yè)類固醇激素的合成男女性激素和皮質(zhì)激素均來(lái)源于共同的前體和合成、代謝途徑，其結(jié)構(gòu)也非常相似。因此皮質(zhì)功能紊亂、肝腎功能紊亂、某些遺傳缺陷、服用類固醇藥物等均可造成這些激素測(cè)定結(jié)果的異常。第48頁(yè)/共89頁(yè)甲狀腺功能指標(biāo)評(píng)價(jià)甲亢的診斷價(jià)值依次為：TSH=FT3＞FT4＞TT3＞TT4甲低的診斷價(jià)值依次為：FT4=TSH＞TT4＞FT3＞TT3發(fā)光法TSH、FT3、FT4提高了靈敏度，使得其臨床意義大于TT4和TT3兩步法操作時(shí)間長(zhǎng)靈敏度差準(zhǔn)確性差類似物法操作時(shí)間短靈敏度較好準(zhǔn)確性較好反向競(jìng)爭(zhēng)法（標(biāo)記抗體）操作時(shí)間短靈敏度更好準(zhǔn)確性更好第一代第二代第三代血清FT3、FT4試劑盒的發(fā)展（消除結(jié)合蛋白對(duì)測(cè)定的影響）TGAbTMAb=TPO抗體第49頁(yè)/共89頁(yè)其生理作用需要通過(guò)生長(zhǎng)介素(SM)介導(dǎo)SM也稱胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)，主要在肝臟及多種GH靶細(xì)胞合成SM-C即IGFI，結(jié)構(gòu)與胰島素有近一半的氨基酸殘基相同。生長(zhǎng)激素（GH）生長(zhǎng)激素紊亂生長(zhǎng)激素缺乏癥（侏儒）巨人癥及肢端肥大癥GH測(cè)定的臨床意義垂體腺瘤、腎癌、肺癌運(yùn)動(dòng)刺激試驗(yàn)藥物刺激試驗(yàn)（胰島素-低血糖試驗(yàn)）GH分泌的抑制試驗(yàn)第50頁(yè)/共89頁(yè)胰島素免疫源性胰島素：采用多抗或普通單抗與胰島素原和C肽有交叉正常值較高糖尿病分型：Ⅰ型空腹胰島素低，OGTT后變化緩慢，甚至無(wú)變化；

Ⅱ型空腹高胰島素，OGTT后胰島素釋放延遲，總量不低。肝硬變：空腹胰島素高于正常2－3倍。OGTT各個(gè)時(shí)相胰島素升高。胰島素瘤：靜脈注入亮氨酸后血中胰島素水平明顯升高。甲亢：初期空腹胰島素水平高，OGTT與正常人相似；長(zhǎng)期嚴(yán)重甲亢可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能衰竭，發(fā)展為糖尿病。真胰島素：采用胰島素原掩蔽性胰島素單抗與胰島素原和C肽無(wú)交叉正常值較低第51頁(yè)/共89頁(yè)C-肽胰島素升高C肽正常，外周血C肽／胰島素比值降低。糖尿病如患者存在胰島素抗體或用外源性胰島素治療，則改為測(cè)定C肽肝硬化生理性升高：禁食及大量活動(dòng)病理性升高：糖尿病，增高數(shù)值和糖尿病的嚴(yán)重程度有關(guān)胰高血糖素胰高血糖素靜脈注射實(shí)驗(yàn)胰高血糖素瘤鑒別評(píng)價(jià)糖尿病人胰島功能第52頁(yè)/共89頁(yè)胰島素抗體GAD是Ⅰ型糖尿病的關(guān)鍵始動(dòng)靶自身抗原其抗體是Ⅰ型糖尿病及前期的重要標(biāo)志長(zhǎng)期用胰島素的病人可產(chǎn)生未用過(guò)胰島素的I型糖尿病人胰島素抗體陽(yáng)性是自身免疫性細(xì)胞損害的標(biāo)志谷氨酸脫羧酶（GAD）抗體與抗胰島細(xì)胞抗體（ICA）相比，GAD-Ab陽(yáng)性率高、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、測(cè)定方法簡(jiǎn)單，有很好的臨床預(yù)見(jiàn)性，可替代ICA。第53頁(yè)/共89頁(yè)性激素LHFSH正常嬰兒和小孩極微；在青春期前開始分泌；女性絕經(jīng)后明顯升高。成年男性含量比較恒定，老年男性因睪丸功能衰減，含量大大升高。垂體瘤切除術(shù)后患者LH和FSH減少，估計(jì)垂體瘤手術(shù)效果有一定價(jià)值性腺發(fā)育不良垂體瘤某些癌癥（肺癌）慢性腎衰腺皮質(zhì)激素治療后異位激素分泌綜合征……垂體性性功能衰退神經(jīng)性厭食使用性激素溢乳閉經(jīng)征青春期延期……第54頁(yè)/共89頁(yè)催乳素瘤好發(fā)于女性表現(xiàn)為泌乳閉經(jīng)多毛痤瘡不育垂體催乳素（hPRL）垂體催乳素瘤、月經(jīng)異常和不孕的病因鑒別，應(yīng)激刺激可引起hPRL的分泌。男性以性功能減退陽(yáng)萎不育垂體壓迫癥狀為主偶見(jiàn)泌乳。第55頁(yè)/共89頁(yè)睪酮睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤真性男性性早熟女性多毛癥皮質(zhì)醇增多癥完全性雄性激素不應(yīng)綜合征……原發(fā)生睪丸功能減退垂體前葉功能減退男性不育高h(yuǎn)PRL血癥紅斑狼瘡骨質(zhì)疏松慢性肝病慢性腎衰……血液中睪酮98%與蛋白結(jié)合，只有游離態(tài)具有生物活性女性性早熟男性乳房發(fā)育紅斑狼瘡肝硬變子宮內(nèi)膜癌乳腺癌糖尿病孕婦……女性性發(fā)育不全多囊卵巢綜合癥葡萄胎妊娠高血壓癥柯興氏綜合癥卵巢囊腫……雌二醇靈敏度要求高第56頁(yè)/共89頁(yè)多胎妊娠17α-羥化酶缺乏癥子宮內(nèi)膜腺癌先兆子癇妊娠高血壓妊娠合并糖尿病胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩卵巢顆粒層膜細(xì)胞瘤……無(wú)排卵性子宮功能性出血閉經(jīng)不孕早產(chǎn)黃體功能不全異位妊娠……孕酮血漿中孕酮絕大部分為結(jié)合型，極小數(shù)為游離型。孕酮與黃體及胎盤關(guān)系密切，用于監(jiān)測(cè)排卵、黃體功能以及判斷妊娠繼續(xù)。第57頁(yè)/共89頁(yè)小分子性激素測(cè)定方法的進(jìn)展（消除蛋白結(jié)合和類似物/前體/代謝產(chǎn)物的干擾）直接測(cè)定法經(jīng)典方法消化樣品↓萃取有機(jī)相↓分子篩柱分離各類甾體↓測(cè)定血清直接測(cè)定+高特異性單抗+結(jié)合蛋白屏蔽技術(shù)第58頁(yè)/共89頁(yè)hCG游離β亞單位試劑β亞單位特異且不與完整的hCG分子結(jié)合的單抗專門測(cè)定hCG的游離β亞單位多用于唐氏綜合征的早期篩查。絨毛膜促性腺激素（hCG）臨床意義早孕、先兆流產(chǎn)的監(jiān)護(hù)、異位妊娠、葡萄胎、絨癌、精原細(xì)胞瘤肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、肝癌、畸胎瘤、唐氏綜合征等。普通型試劑多抗受其它激素干擾靈敏度不高βhCG試劑β亞單位特異單抗特異性和靈敏度較高第59頁(yè)/共89頁(yè)分類:特異性——特定腫瘤時(shí)才會(huì)顯著性升高

輔助性——正常情況下也可產(chǎn)生，在發(fā)生腫瘤時(shí)急劇升高腫瘤標(biāo)志物定義：由腫瘤細(xì)胞合成、釋放，或者是機(jī)體受腫瘤刺激而產(chǎn)生的物質(zhì)。用途：高危人群的早期篩查腫瘤確診病人的療效觀察和預(yù)后分析。性質(zhì)：胚胎源性、含糖物質(zhì)、酶、激素，其它蛋白質(zhì)不能單純依賴腫瘤標(biāo)志物確診腫瘤第60頁(yè)/共89頁(yè)原發(fā)性結(jié)腸癌（45－90%）腺胰、膽管、胃、食道、肺、乳腺癌和泌尿系腫瘤（50－70%）結(jié)腸癌術(shù)后1－3周內(nèi)血CEA可下降到正常，如持續(xù)陽(yáng)性說(shuō)明切除不全或轉(zhuǎn)移，提示預(yù)后差或有復(fù)發(fā)可能乳頭狀癌時(shí)膽汁CEA檢測(cè)特異性100%良性腫瘤、炎癥和退行性疾病、吸煙者可小幅升高原發(fā)性肝癌（90%）手術(shù)療效和預(yù)后判斷指標(biāo)其它腫瘤（胃癌、結(jié)腸癌）

各種胎兒發(fā)育缺陷、低氧癥、死胎肝良性病變（肝炎）輕度增高甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA）升高唐氏綜合癥降低第61頁(yè)/共89頁(yè)上皮性卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的標(biāo)志物漿液性子宮內(nèi)膜樣癌、透明細(xì)胞癌、輸卵管癌、未分化卵巢癌卵巢癌復(fù)發(fā)早期增高良性卵巢疾患（3%-6%）、懷孕期前3個(gè)月、行經(jīng)期、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮纖維變性、急性輸卵管炎、肝病、胸腹膜和心包感染可稍有上升CA15-3乳腺癌（30-50%）、肺癌、肺腺癌及卵巢癌乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移妊娠可引起升高CA125胰腺癌和結(jié)、直腸癌，腫瘤切除后如再次上升表示復(fù)發(fā)。膽囊癌、膽管癌、肝癌、胃癌也升高膽道癌膽汁檢測(cè)靈敏度100%胰腺癌膽汁檢測(cè)靈敏度76.5%,特異性96.4%胰腺炎和黃疸時(shí)可呈一過(guò)性增高普遍性腫瘤標(biāo)志相關(guān)抗原，不是特指某個(gè)器官的腫瘤標(biāo)志物。胰腺癌、膽囊癌（90%）；肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、卵巢腫瘤胰腺炎、結(jié)腸炎和肺炎時(shí)，也會(huì)升高CA50CA199第62頁(yè)/共89頁(yè)是目前小細(xì)胞肺癌最敏感最特異的腫瘤標(biāo)志物之一，陽(yáng)性率65%-100%NSE水平與小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移程度相關(guān)，與轉(zhuǎn)移的部位無(wú)關(guān)治療前后動(dòng)態(tài)觀察血清NSE濃度可以監(jiān)測(cè)小細(xì)胞肺癌的治療效果。水溶性鐵貯存蛋白，具有不同的同工鐵蛋白圖譜。酸性同分異構(gòu)體鐵蛋白增高與白血病、肺癌、乳腺癌有關(guān)肝癌時(shí)如果AFP測(cè)定值較低，可用鐵蛋白測(cè)定結(jié)果作為補(bǔ)充證據(jù)色素沉著旺盛、炎癥，尤其是肝炎時(shí)，鐵蛋白也會(huì)升高神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）鐵蛋白（Frri）第63頁(yè)/共89頁(yè)目前國(guó)際上強(qiáng)調(diào)用等克分子反應(yīng)的單克隆抗體檢測(cè)PSA，否則測(cè)定值偏高。但美國(guó)很多公司甚至大公司的多種PSA試劑盒均未采用等克分子抗體，目前在歐洲已被逐漸排擠出市場(chǎng)。前列腺特異抗原(PSA)前列腺癌篩查和治療后監(jiān)控良性前列腺疾病也可升高女性乳腺癌患者中可檢出FPSA/TPSA值25%良性前列腺增生前列腺癌0100%前列腺癌的特異性標(biāo)志物，少數(shù)幾個(gè)器官特異性腫瘤標(biāo)志物之一第64頁(yè)/共89頁(yè)地高辛測(cè)定易受地高辛的某些代謝物，以及某些內(nèi)源性類固醇物質(zhì)的干擾取血應(yīng)在服藥10天以后及最后一次服藥16小時(shí)（出現(xiàn)中毒除外）0.82.03.04.0ng/ml血清濃度治療劑量＞80%病人心律紊亂治療心房纖顫和心房撲動(dòng)除外高度懷疑中毒注意特征性心率失常和心電圖改變必須停藥考慮搶救措施第65頁(yè)/共89頁(yè)MoM正常人群中位數(shù)的倍數(shù)，即正常人群為1.0MoM唐氏綜合征的實(shí)驗(yàn)室診斷母體血清AFP低于1.0MoM（0.47-0.86MoM，均值0.65MoM）母體血清游離β-hCG亞單位孕早期顯著高于正常妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)孕早期顯著降低PAPP-A和游離β-hCG亞單位聯(lián)合應(yīng)用8-14周時(shí)檢出率62%，假陽(yáng)性率為5%；孕15-22周檢出率為59%第66頁(yè)/共89頁(yè)1987年研究，1991年申請(qǐng)化學(xué)發(fā)光液專利（幾乎與國(guó)外同步）。1995年獲得上述專利，開始研制單光子計(jì)數(shù)式發(fā)光儀。1997年研制成功第一代微孔板單光子計(jì)數(shù)式發(fā)光分析儀,開發(fā)出部分發(fā)光免疫試劑盒。2000年獲得單光子計(jì)數(shù)器專利，開始發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的新藥申報(bào)。2003年獲醫(yī)療器械和藥品生產(chǎn)許可證，正式批量生產(chǎn)。源德的發(fā)展歷程第67頁(yè)/共89頁(yè)自主開發(fā)出具有國(guó)際水平的發(fā)光底物在國(guó)際上率先創(chuàng)立的分程增敏、輔助增敏、坪區(qū)延長(zhǎng)和干擾屏蔽技術(shù)使發(fā)光靈敏度和線性范圍均比同類技術(shù)提高一個(gè)數(shù)量級(jí)坪區(qū)（信號(hào)穩(wěn)定期）和抗干擾能力也明顯提高因而使試劑盒的穩(wěn)定性、線性范圍超過(guò)了國(guó)外同類產(chǎn)品而且還克服了酶促發(fā)光固有的工作曲線漂移、低端斜率非線性下降等不足第68頁(yè)/共89頁(yè)第69頁(yè)/共89頁(yè)第70頁(yè)/共89頁(yè)

本底噪音最低檢測(cè)限線性范圍穩(wěn)定性（RLU/0.1秒)(HRPpg/樣品)(HRPpg/樣品)(平均變異系數(shù))

某國(guó)外產(chǎn)品27±3.10.1±0.010.1--204.824.4自行研制7±0.90.01±0.010.01--819.25.5發(fā)光液的主要技術(shù)性能比較第71頁(yè)/共89頁(yè)本公司發(fā)光底物美國(guó)某知名公司發(fā)光底物第72頁(yè)/共89頁(yè)國(guó)際領(lǐng)先的免疫測(cè)定試劑盒我們攻克了發(fā)光液貯存、抗體玻璃化及標(biāo)記物穩(wěn)定劑等相關(guān)配套技術(shù)，使試劑盒的有效期和穩(wěn)定性達(dá)到了國(guó)際水平。第73頁(yè)/共89頁(yè)甲狀旁腺功能類、腎上腺功能類、貧血類、維生素類、產(chǎn)前篩查、新生兒疾病篩查、甲型、丙型肝炎類、艾滋病檢測(cè)…

…

FSH、LH、PRL、T、P、E2、HCG、GH……ASA、AEA、ACA、AOA

……肝炎標(biāo)志物類HBV（定性、定量）……甲狀腺激素類TT3、TT4、FT3、FT4、TSH糖尿病類INS、C-P、INS-Ab、GAD-Ab性激素類腫瘤標(biāo)志類PSA、FPSA、CEA、AFP、NSE、Ferr、CA-50、CA-125、CA-153、CA-199……優(yōu)生優(yōu)育類TORCH（IgM、IgG）不育不孕類八大類近60個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目第74頁(yè)/共89頁(yè)率先建立了用發(fā)光免疫法直接檢測(cè)患者血清內(nèi)SARS病毒的技術(shù)為更早期發(fā)現(xiàn)SARS病例提供了快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)的技術(shù)手段。第一個(gè)在中國(guó)境內(nèi)注冊(cè)并正式合法生產(chǎn)的發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒。全球第一個(gè)SARS冠狀病毒抗原檢測(cè)試劑盒新藥證書和藥品生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)第75頁(yè)/共89頁(yè)國(guó)際領(lǐng)先的發(fā)光檢測(cè)儀制造技術(shù)高線性度光電校正光源，大大提高了單光子計(jì)數(shù)儀的可靠性和一致性。我們還在國(guó)際上首先提出了雙量程自動(dòng)轉(zhuǎn)換單光子計(jì)數(shù)器的設(shè)計(jì)思想在充分保持高靈敏度特性的基礎(chǔ)上大大拓寬了線性范圍，達(dá)到108左右而一般單量程計(jì)數(shù)器的線性范圍不超過(guò)106。第76頁(yè)/共89頁(yè)我們的儀器產(chǎn)品微孔板發(fā)光免疫分析系統(tǒng)新型模塊化全自動(dòng)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)基于發(fā)光檢測(cè)技術(shù)的食品農(nóng)藥殘留檢測(cè)設(shè)備微生物污染現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)試產(chǎn)品…第77頁(yè)/共89頁(yè)JETLIA-96/2內(nèi)置電腦自動(dòng)加液型發(fā)光免疫分析儀第78頁(yè)/共89頁(yè)AUTOLIA-12/48型全自動(dòng)發(fā)光免疫分析儀第79頁(yè)/共89頁(yè)國(guó)際上為數(shù)不多的在整個(gè)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)所有領(lǐng)域內(nèi)都具備自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的企業(yè)之一。被美國(guó)《時(shí)代》周刊收入的某微型全自動(dòng)發(fā)光免疫檢測(cè)儀，在其技術(shù)更新中也曾征詢過(guò)我們的建議。當(dāng)選國(guó)際生物發(fā)光及化學(xué)發(fā)光學(xué)會(huì)（InternationalSocietyonBioluminescence&Chemiluminescence:ISBC）學(xué)術(shù)理事（CouncilMemberofScientificAdvisoryBoard）和申辦ISBC國(guó)際會(huì)議為標(biāo)志，我們已經(jīng)成為國(guó)際化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)研究中心之一。SUMMARY第80頁(yè)/共89頁(yè)試劑生產(chǎn)車間主樓第81頁(yè)/共89頁(yè)一樓接待大廳第82頁(yè)/共89頁(yè)二樓商務(wù)中心第83頁(yè)/共89頁(yè)GMP潔凈車間第84頁(yè)/共89頁(yè)質(zhì)檢中心第85頁(yè)/共89頁(yè)研發(fā)中心第86頁(yè)/共89頁(yè)儀器裝配線局部第87頁(yè)/共89頁(yè)%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVn%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhT#r%v(y0B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9PgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZu(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v