高效液相色譜法應(yīng)用講座

關(guān)于高效液相色譜法應(yīng)用講座第1頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日HPLC實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)知HPLC操作操作流程流動(dòng)相的配制色譜柱使用與維護(hù)實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理第2頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日1概述

定義分離模式與主要分離機(jī)制基本術(shù)語正相與反相色譜HPLC的特點(diǎn)問題思考第3頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日定義HPLC——用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。第4頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介儀器組成根據(jù)需要配置流動(dòng)相在線脫氣裝置、梯度洗脫裝置、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、柱后反應(yīng)系統(tǒng)等。第5頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日泵輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)＜0.5%，這對(duì)定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100ml/min；③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150~300kg/cm2；④液缸容積??；⑤密封性能好，耐腐蝕。

第6頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)

①防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，常用的方法是濾過，輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。

②流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長(zhǎng)時(shí)間的情況下。

③溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完。

④輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。

第7頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日附：高效液相色譜儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進(jìn)樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測(cè)器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置泵第8頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日1.2HPLC分離模式與主要分離機(jī)制分離模式主要保留機(jī)制液-固吸附吸附劑的表面吸附鍵合相溶質(zhì)在兩相間的分配或溶質(zhì)與極性固定相的吸附離子交換溶質(zhì)離子與填料上的反電荷層之間的相互作用離子對(duì)電中性離子對(duì)在兩相間的分配分子排阻基于流體動(dòng)力學(xué)體積的過濾作用手性溶質(zhì)手性異構(gòu)體與填料手性作用點(diǎn)間非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體相互作用。親和溶質(zhì)與固定化配體間生化專屬結(jié)合第9頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日正相色譜法與反相色譜法

正相色譜法

反相色譜法

第10頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日正相與反相

正相色譜法

反相色譜法

固定相極性

高～中

中～低

流動(dòng)相極性

低～中

中～高

組分洗脫次序

極性小先洗出

極性大先洗出

第11頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日正相：流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↑，k↓，組分tR↓反相：流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑第12頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日1.3特點(diǎn)

適用范圍寬：現(xiàn)在絕大部分化學(xué)類藥品皆可采用該儀器分析。分離效率高：復(fù)方分析、輔料干擾時(shí)等情況下，更顯示其威力。速度快：一般出峰時(shí)間均在30min以內(nèi)。第13頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日靈敏度高：可檢測(cè)物質(zhì)達(dá)10-9g左右，一般最低檢測(cè)濃度均可達(dá)10-1~10-3μg/ml（進(jìn)樣體積10~20μl）。并可通過使用不同的檢測(cè)器，測(cè)定不同物質(zhì)，或再提高測(cè)定靈敏度。第14頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日色譜柱可反復(fù)使用：一般保存好，均可達(dá)2年以上。流出的組分容易收集：可用于制備色譜或價(jià)格極為昂貴的物質(zhì)收集。第15頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日

安全：僅有一些有機(jī)溶劑的污染（使用時(shí)，流動(dòng)相口要密封，一者以免揮發(fā)，流動(dòng)相中各組分比例不準(zhǔn)，二者防止揮發(fā)，污染環(huán)境），比氣相要安全的多。

第16頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日1.4思考1、為什么說分離度與重復(fù)性是系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)指標(biāo)中是更具有實(shí)用意義的參數(shù)？2、影響柱效的因素有哪些？3、影響分離度的因素有哪些？4、影響重復(fù)性的因素有哪些？Rs儀器第17頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日影響分離的因素1．第18頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日思考psi、bar、Mpa如何換算？乙醇為什么不常用作流動(dòng)相？第19頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日2、HPLC操作操作流程開機(jī)最后開檢測(cè)器配制流動(dòng)相流動(dòng)相平衡，在此過程和適當(dāng)時(shí)候調(diào)節(jié)柱溫、流速、流動(dòng)相比例。必要時(shí)要選柱子。配制對(duì)照品、樣品溶液。系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)進(jìn)樣數(shù)據(jù)處理關(guān)機(jī)先關(guān)檢測(cè)器，后沖洗第20頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日流動(dòng)相的配制流動(dòng)相應(yīng)具有的特點(diǎn)流動(dòng)相脫氣流動(dòng)相過濾除去微粒流動(dòng)相貯存流動(dòng)相極性與截止波長(zhǎng)流動(dòng)相調(diào)pH值思考題第21頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：

a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。

b、流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。

c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。

第22頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。

e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。

第23頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日流動(dòng)相為什么要脫氣流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD，可能會(huì)造成熒光猝滅。

第24頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日常用的脫氣方法比較氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。

加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。

抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。

第25頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日常用的脫氣方法比較超聲脫氣法：流動(dòng)相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果最差。

在線真空脫氣法：Agilent1100LC真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)，在線脫氣，智能控制，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。第26頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日壓力、溫度與氣泡壓力減少時(shí)要產(chǎn)生氣泡溫度升高時(shí)要產(chǎn)生氣泡第27頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日防止產(chǎn)生新的氣泡沿管壁緩緩倒入先混合后脫氣梯度洗脫預(yù)先“部分混合”第28頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日為什么要濾除微粒為什么溶劑和樣品要過濾?

色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。

儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會(huì)增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。要正確選用濾膜第29頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日流動(dòng)相的貯存流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長(zhǎng)霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過。第30頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日流動(dòng)相的貯存容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長(zhǎng)的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象。第31頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日6，流動(dòng)相常用溶劑的極性和截止波長(zhǎng)由極性可以看出，在反相色譜中，要使出峰時(shí)間加快，可增加流動(dòng)相中的乙腈比例，但要注意分離度的減??；若要使出峰時(shí)間減慢，可增加流動(dòng)相中水的比例，增加水的比例還會(huì)引起分離度的增加；兩者之間綜合來考慮。四氫呋喃使用時(shí)注意波長(zhǎng)。必須選用色譜級(jí)的。

第32頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日

由于甲醇的極限波長(zhǎng)為210nm左右，故短波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)，最好不要采用甲醇，而用乙腈。

樣品稀釋用溶劑的選擇：測(cè)定有關(guān)物質(zhì)時(shí)最好選用流動(dòng)相，避免以溶劑峰的干擾，水往往出倒峰。各溶劑截止波長(zhǎng)第33頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日流動(dòng)相的pH值

采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時(shí)，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，情況相反。第34頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

注：流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。第35頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日流動(dòng)相的配制緩沖鹽溶液濃度不要配錯(cuò)，臨用新配調(diào)PH時(shí)一般在水相調(diào)，當(dāng)流動(dòng)相中有機(jī)相比例較高時(shí)無法調(diào)。第36頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日思考題1、流動(dòng)相流速與組成與保留時(shí)間的關(guān)系如何？2、流速與柱效、峰面積的關(guān)系3、乙腈與甲醇在應(yīng)用上的區(qū)別。4、水與有機(jī)相混合比例不同，會(huì)引起粘度變化嗎？5、流動(dòng)相有時(shí)為什么要調(diào)pH？6、流動(dòng)相配好后可用多長(zhǎng)時(shí)間？第37頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日色譜柱的使用與維護(hù)閱讀說明書安裝時(shí)注意方向如何排氣泡？反相柱C-18或C8當(dāng)用含緩沖鹽或表面活性劑的流動(dòng)相后，要沖洗干凈。第38頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日色譜柱的使用與維護(hù)色譜柱不用、存放時(shí)，兩頭柱塞一定塞住，防止柱內(nèi)溶劑揮干,否則容易揮發(fā)干損傷柱子。分析生化樣品、血液制品和手性色譜柱時(shí)，最好加一預(yù)柱以保護(hù)。流動(dòng)相極性及流速（壓力）不要突變。第39頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日（1）色譜柱不能夠碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震蕩；安裝時(shí)，一定要保證閥件或管路的清潔。（2）盡量不使用或少使用高粘度的流動(dòng)相。（3）在滿足靈敏度的情況下，盡可能使用小進(jìn)樣量。如果樣品比較“臟”，要進(jìn)行凈化或提純處理。第40頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日柱溫控制柱溫箱的作用：1、保留時(shí)間精確再現(xiàn)2、提高分離效率3、對(duì)高分子化合物或黏度大的樣品，分析時(shí)柱溫必須高于室溫。4、對(duì)一些具有生物活性的生物分子，要求低的柱溫第41頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日系統(tǒng)平衡1.除上所述外，流動(dòng)相配制時(shí)還需注意什么？2.流動(dòng)相沖洗多長(zhǎng)時(shí)間平衡？如何平衡？3.有表面活性劑時(shí)小流速過夜，再到規(guī)定流速30min。4.基線什么情況下才算平衡？第42頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日配制樣品和對(duì)照品溶液2．配制：①溶劑；②容器：塑料容器常含有高沸點(diǎn)的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會(huì)吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會(huì)被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收。3對(duì)照品稱量問題

第43頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日預(yù)試預(yù)試目的n，R是否符合要求；保留時(shí)間是否合適調(diào)節(jié)色譜條件流動(dòng)相組成流速柱溫柱子

第44頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。

當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。第45頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日流速和柱溫均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)測(cè)定的需要。如含量測(cè)定時(shí)，可適當(dāng)加大流速和提高柱溫；改變柱溫和流速降低均可提高分離效果。第46頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日第一次測(cè)定時(shí)，應(yīng)先將空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液各進(jìn)一針，并盡量收集較長(zhǎng)時(shí)間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數(shù)及是否還有雜質(zhì)峰在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)才洗脫出來，確定是否會(huì)影響主峰的測(cè)定。

第47頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日4．進(jìn)樣量：藥品標(biāo)準(zhǔn)中常標(biāo)明注入10ul而目前多數(shù)HPLC系統(tǒng)采用定量環(huán)（10ul、20ul和50ul），因此應(yīng)注意進(jìn)樣量是否一致。（可改變樣液濃度）第48頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)含量測(cè)定對(duì)照品2份,樣品2份;有關(guān)物質(zhì),對(duì)照品一份,樣品一份。每份對(duì)照品進(jìn)樣三次，計(jì)算RSD%。系統(tǒng)適應(yīng)性符合要求后，再進(jìn)樣?；蛘咭环輰?duì)照品先進(jìn)5針，計(jì)算RSD%符合要求，實(shí)驗(yàn)過程或?qū)嶒?yàn)結(jié)束進(jìn)另一份對(duì)照品核對(duì)，范圍應(yīng)在98%~102%之間第49頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日樣品測(cè)定含量測(cè)定樣品2份，每份1針;有關(guān)物質(zhì)樣品1份,每份2針。為了考察系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)過程中的穩(wěn)定性。適當(dāng)間隔再進(jìn)標(biāo)樣核對(duì)。有關(guān)物質(zhì)檢查時(shí)，空白應(yīng)進(jìn)1針。含量測(cè)定可不做。自身對(duì)照進(jìn)幾針？第50頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日10.3．應(yīng)盡量保持樣品溶液和對(duì)照品溶液使用同一溶劑。含量測(cè)定時(shí)一般可以做到，溶出度測(cè)定時(shí)，往往有所差異，通過先濃配后，再用該溶劑稀釋的辦法進(jìn)行，比例盡可能小。第51頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日儀器沖洗如何沖洗一般溶劑緩沖梯度第52頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日檢測(cè)器類型最通用的紫外檢測(cè)器：注意測(cè)定波長(zhǎng)較短時(shí)，基線有可能會(huì)飄；洗柱子時(shí)，盡量關(guān)閉光源，以延長(zhǎng)使用壽命。二極管陣列檢測(cè)器：目前使用者越來越多。用于多波長(zhǎng)檢測(cè)、峰純度測(cè)定、對(duì)被測(cè)定物質(zhì)進(jìn)行紫外掃描后選擇波長(zhǎng)等用途。

第53頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日

10.二極管陣列檢測(cè)器的應(yīng)用

采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行論證，也是目前常采用的一個(gè)強(qiáng)有力的手段。它通過對(duì)一個(gè)色譜峰的數(shù)點(diǎn)進(jìn)行紫外掃描，然后比較所得到的掃描圖譜的接近程度從而評(píng)價(jià)被檢測(cè)峰的純度。

第54頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日利用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行峰純度檢查的缺點(diǎn)：（1）雜質(zhì)濃度低，或與主成分相比吸收太小，達(dá)不到檢測(cè)靈敏度，無法檢測(cè)出來。（2）當(dāng)雜質(zhì)的發(fā)色團(tuán)與主成分一致，或者說雜質(zhì)與主組分有相同或幾乎相同的光譜圖且具相近的流出時(shí)間，此時(shí)雜質(zhì)也無法發(fā)現(xiàn)。第55頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日熒光檢測(cè)器：靈敏度更高，對(duì)那些μg級(jí)的制劑品種，有時(shí)適用。但缺點(diǎn)是，基線穩(wěn)定需平衡時(shí)間較長(zhǎng)。示差折光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器（電導(dǎo)檢測(cè)器）等。第56頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日檢測(cè)最小峰面積的設(shè)定峰純度的測(cè)定自身對(duì)照法與歸一化法的區(qū)別結(jié)果計(jì)算第57頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日8．定量分析8.1外標(biāo)法：計(jì)算公式：

使用時(shí)應(yīng)注意盡量保持樣品溶液和對(duì)照品溶液濃度相同第58頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日

8.2內(nèi)標(biāo)法：計(jì)算公式：第59頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日8.3歸一化法和自身對(duì)照法：為有關(guān)物質(zhì)（雜質(zhì)）的測(cè)定方法。這是通過峰面積的比較來推算出各物質(zhì)質(zhì)量比例的方法。目前多采用自身對(duì)照法來進(jìn)行。(1)歸一化法：即一個(gè)峰的峰面積（雜質(zhì)峰）占總峰面積或占主峰面積的多少。由于有關(guān)物質(zhì)測(cè)定時(shí)，總峰面積的絕大部分均為主峰面積，故兩者結(jié)果差不多，結(jié)果基本一致。第60頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日(2)自身對(duì)照法：通常是將供試品溶液稀釋一定倍數(shù)后（通常為100倍）作為對(duì)照溶液（這里對(duì)照溶液與對(duì)照品溶液的區(qū)別需要強(qiáng)調(diào)一下），將其和供試品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定，供試品溶液色譜圖中的每個(gè)雜質(zhì)峰面積，與對(duì)照溶液主成分峰面積進(jìn)行比較或計(jì)算進(jìn)行對(duì)雜質(zhì)的判斷。如比較，直接比峰面積大小，如計(jì)算，則采用公式計(jì)算雜質(zhì)含量。第61頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日如果該物質(zhì)線性關(guān)系良好，稀釋100倍，峰面積還呈線性的話，那么，歸一化法和自身對(duì)照法所得結(jié)果基本是一致的（最多差0.02%左右）。但如果稀釋100倍，峰面積不呈線性的話，那么，歸一化法和自身對(duì)照法所得結(jié)果將有所差異，如此時(shí)采用歸一化法，將得不到較為正確的結(jié)果，因?yàn)榇藭r(shí)，峰面積已不能較為準(zhǔn)確地表示質(zhì)量；而采用自身對(duì)照法，則可避免該情況的發(fā)生，這也是目前推薦采用該法的原因所在。第62頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日用紫外檢測(cè)器，一般化合物的線性范圍可達(dá)1~106或107，但也有一些測(cè)定物質(zhì)，線性范圍較窄，此時(shí)便需要摸索其范圍，但又不能單純考慮線性范圍，還應(yīng)著重考慮供試品溶液的濃度才是最為重要的。第63頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日制劑測(cè)定中注意事項(xiàng)：1.紫外鑒別中輔料的干擾，易使最大吸收波長(zhǎng)偏離。2.含量均勻度采用先加水浸泡使溶漲，再超聲使崩散，再加有機(jī)溶劑使主藥溶解的辦法進(jìn)行，準(zhǔn)確、可靠、易行。第64頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日3.溶出度測(cè)定時(shí)如靈敏度不夠，可通過加大進(jìn)樣量的辦法解決。對(duì)照品溶液配制、測(cè)定值偏高、過濾損失等問題一定要注意。4.含量測(cè)定濃度設(shè)定得盡可能低些。測(cè)定值與投料量的吻合性。色譜條件可與有關(guān)物質(zhì)測(cè)定時(shí)的不一致。第65頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日5.有關(guān)物質(zhì)注意輔料的影響，可規(guī)定主峰保留時(shí)間幾倍前的輔料峰不計(jì)。單個(gè)雜質(zhì)的設(shè)定。6勿需去除薄膜衣、糖衣！第66頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日2.5中國(guó)藥典具體品種存在問題舉例：1.甲硫酸新斯的明注射液含量測(cè)定采用定氮法；BP同品種采用UV、E值法測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、易行。2.甲磺酸酚妥拉明及其注射液含量測(cè)定均采用沉淀法，經(jīng)多次操作后測(cè)定，該法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且易造成損失、使結(jié)果偏低；BP和USP同品種均采用氫氧化四丁基銨直接滴定的方法，操作簡(jiǎn)便、易行。第67頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日克霉唑含量測(cè)定采用對(duì)照品、容量分析滴定法測(cè)定。但未給出滴定度，故滴定時(shí)不知該選用何種體積的滴定管和大約消耗的體積數(shù)，使試驗(yàn)人員需經(jīng)多次試驗(yàn)進(jìn)行摸索，浪費(fèi)了人力、物力。4.酮康唑乳膏 含量測(cè)定采用有機(jī)溶劑多次提取，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且必造成一定的損失（至少5%）。應(yīng)改為采用甲醇破壞基質(zhì)、溶解主藥后，離心，取上清液直接進(jìn)行HPLC法測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，便于操作。第68頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日5.鹽酸布比卡因注射液 含量測(cè)定極為煩瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；BP和USP同品種采用HPLC法測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、易行。6.提高辦法，及時(shí)更改、完善!第69頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日思考：下圖說明什么？第70頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日找原因如圖所示：同一份溶液進(jìn)樣兩次。怎么會(huì)多出一個(gè)峰第71頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日同一樣品兩份溶液，各自進(jìn)樣，出現(xiàn)圖示結(jié)果什么原因？第72頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日找原因圖示：上圖為空白溶劑。中圖為樣品溶液。下圖為自身對(duì)照。什么原因？第73頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日主峰不見了右圖為空白溶劑圖譜實(shí)驗(yàn)人員說在樣品的圖譜上主峰不見了，怎么回事？第74頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日提高分離度有什么途徑？①增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長(zhǎng)，但這樣會(huì)延長(zhǎng)保留時(shí)間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當(dāng)α＝1時(shí)，R＝0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a.改變流動(dòng)相的組成及pH值；b.改變柱溫c.改變固定相。第75頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日提高分離度有什么途徑？③改變?nèi)萘恳蜃?。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成來實(shí)現(xiàn)。k2趨于0時(shí)，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時(shí)間延長(zhǎng)，而且峰形變寬，會(huì)影響分離度和檢測(cè)靈敏度。一般k2在1~10范圍內(nèi)，最好為2~5，窄徑柱可更小些。

第76頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日為什么要梯度洗脫樣品的保留范圍寬樣品分子量樣品中含強(qiáng)保留成份樣品稀溶液的柱上濃縮第77頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日梯度洗脫時(shí)應(yīng)注意什么問題？①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時(shí)更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時(shí)，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心第78頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日

②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后會(huì)被強(qiáng)溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡。第79頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日梯度洗脫時(shí)應(yīng)注意什么問題？③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時(shí)粘度增大很多，此時(shí)的柱壓大約是甲醇或水為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。

第80頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日梯度洗脫時(shí)應(yīng)注意什么問題？④每次梯度洗脫之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。1.在100%B結(jié)果運(yùn)行一定時(shí)間(2~5個(gè)柱體積)以洗脫干擾物,或在每次分析結(jié)束后,快速自最終B%結(jié)果運(yùn)行一梯度至于100%B并維持一段時(shí)間柱平衡:指用起始流動(dòng)相沖洗色譜柱達(dá)到兩相平衡。在每次進(jìn)樣前，用同方法及時(shí)間平衡色譜柱。方法：5~10柱體積（7~15ml，對(duì)150mm?4.6mm）。也可用反梯度平衡穩(wěn)固需讓10~30倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡。

第81頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日梯度洗脫時(shí)，基線為什么漂移在梯度洗脫中，基線漂移是常見的，尤其是低檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)更為嚴(yán)重。這是由于A和B溶劑UV吸收不同造成的。這種UV吸收相關(guān)的漂移可用吸收匹配法消除。向A溶劑加UV吸收物。注意：用UV低波長(zhǎng)及高靈敏度檢測(cè)時(shí)，運(yùn)行空白試驗(yàn)，在色譜圖中常常會(huì)出現(xiàn)一些“非樣品峰，這些峰來自流動(dòng)相及污染的色譜系統(tǒng)。第82頁，共93頁，2023年，2月20日，星期日與檢測(cè)器有關(guān)的故障及其排除1）流動(dòng)池內(nèi)有氣泡

如果有氣泡連續(xù)不斷地通過流動(dòng)池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會(huì)在基線上出現(xiàn)許多線狀"峰"，這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，需要對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行充分的除氣，檢查整個(gè)色譜系統(tǒng)是否漏氣，再加大流量驅(qū)除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡。如果氣泡停留在流動(dòng)池內(nèi)，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（最好不連接色譜柱）；第83頁，