基因藥物分析

基因藥物分析第1頁/共48頁第一節(jié) 概述

什么是生物藥物

利用生物體、生物組織或器官等成分，綜合運用生物學、生物化學、微生物學、免疫學、物理化學合藥學的原理與方法制得的藥物。

廣義的生物藥物包括各種天然生物活性物質以及人工合成或半合成的天然物質類似物。第2頁/共48頁生化藥物Biochemicaldrugs生物技術藥物Bio-technologydrugs生物制品Biologicalproducts生物提取物生物-化學半合成現(xiàn)代生物技術

什么是生化藥物和基因工程藥物？生物藥物生命基本物質及其衍生物、降解物、結構修飾物等運用生物技術進行新藥研發(fā)如基因工程藥物生物技術生物材料制備第3頁/共48頁

什么是基因工程藥物（Geneticengineeringdrugs）？功能蛋白預防、治療某種疾病調控基因的分離、純化或人工合成控制蛋白合成DNA重組技術可大量生產(chǎn)的受體細胞導入細菌、酵母菌、動植物及其細胞基因的繁殖表達發(fā)現(xiàn)第4頁/共48頁

生化藥物和基因工程藥物的種類生化藥物基因工程藥物氨基酸、多肽、蛋白質酶類與輔酶類多糖類脂質類核酸及其降解物、衍生物主要成分為多肽或蛋白質激素類及神經(jīng)遞質類細胞因子類酶類及凝血因子類…第5頁/共48頁

生化藥物和基因工程藥物的特點

來源均為生物體，并都具一定的生物活性和生物功能；

治療疾病的針對性強、毒副作用小、易為人體吸收；

分子量大，且往往不是定值；

結構確證難；

質量對多種因素敏感，需進行全程質量控制；

需進行生物活性檢查、安全性檢查、效價檢查等；第6頁/共48頁第二節(jié)質量檢驗的基本程序與方法理化鑒別法生化鑒別法生物鑒別法化學鑒別法UV光譜法HPLC法顯色、沉淀等肽圖譜酶法電泳法脫鹽后等電聚焦法利用酶的專屬性利用帶電荷差異利用等電點差異利用生物體進行試驗來鑒別藥物1.鑒別第7頁/共48頁2.雜質檢查

一般雜質檢查：原料藥的檢查同化學藥物多糖類：檢查低聚糖、核酸、蛋白質等；

特殊雜質檢查：酶類：酶催化反應基本產(chǎn)物分析，相關酶 的檢查；（生化藥物）第8頁/共48頁

基因工程藥物的生產(chǎn)涉及到生物材料和生物學過程，因此可能會存在很多傳統(tǒng)生產(chǎn)方法不可能存在的有害雜質。生產(chǎn)過程中雜質的檢查（尤其是基因工程藥物）基因工程藥物質量控制必須結合最終產(chǎn)品、有效的中間測試以及有效的方法來去除可能的雜質。如：原核細胞中表達的產(chǎn)品可能含有內毒素、致敏原如：動物細胞中表達的產(chǎn)品可能含有DNA雜質或病毒第9頁/共48頁3.安全性檢查

熱原和細菌內毒素檢查法

過敏試驗——檢查異性蛋白：有可能存在異性蛋白的藥物應作過敏試驗。

異常毒性試驗（異常毒性檢查法）：用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗動物，觀察其急性毒性反應。反應的判斷以試驗動物死亡與否為終點。第10頁/共48頁

降壓物質檢查法：降壓物質是指某些藥物中含有的能導致血壓降低的雜質，包括組胺、類組胺或其他導致血壓降低的物質。

無菌檢查法——檢查藥品及敷料是否染有活菌：無菌檢查指示控制制品染菌狀況的一種檢測手段。要使藥品真正達到無菌，首先應嚴格執(zhí)行GMP管理制度。第11頁/共48頁

致突變試驗

生殖毒性試驗

可能的雜質：殘留DNA、宿主細胞蛋白質、內毒素、蛋白質突變體和蛋白裂解物等

基因工程藥物中可能的雜質與污染物檢查

可能的污染物：微生物、熱原和病毒等第12頁/共48頁4.含量（效價）測定

含量測定效價測定（％）(生物效價或酶活力單位）HPLC法適用對象：結構明確的小分子或水解后變成小分子的藥物酶類或蛋白質藥物測定：以體內或體外法測定參考品的生物學活性SDS法(蛋白質)同時測定蛋白質含量，計算特異比活性，以單位數(shù)/毫克蛋白（IU/mg）標示第13頁/共48頁第三節(jié)常用定量分析方法及其應用主要包括理化分析法、生化測定法和生物檢定法一.理化分析法化學分析法：光譜分析法：色譜分析法：重量法、容量法、電化學分析等比色法，紫外、熒光分光光度法等高效液相，灌注色譜等第14頁/共48頁

重量法：根據(jù)樣品中分離出的單質或化合物的重量測定所含成分的含量。1．提取法：用適宜的溶劑提取出樣品中的某種成分，再蒸去溶劑進行測定。2．揮發(fā)法：利用被測組分具有揮發(fā)性，或將它轉化為揮發(fā)性物質來進行含量測定的方法。3．沉淀法：利用沉淀反應，將被測組分轉化成難溶物，以沉淀形式從溶液中分離出來，然后經(jīng)過濾、洗滌、烘干或熾灼，最后稱重并計算其含量的方法。

化學分析法：重量法、滴定分析、電化學分析第15頁/共48頁

滴定分析法：根據(jù)樣品中某些成分與標準溶液能定量地發(fā)生酸堿中和、氧化還原或絡合反應等進行測定例：用電位滴定法測定L－鹽酸精氨酸含量；胰淀粉酶的效價測定：以淀粉為底物，經(jīng)淀粉酶水解后產(chǎn)生還原糖，在堿性溶液中還原糖又將斐林試劑中的Cu2＋還原成Cu＋，多余的Cu＋在酸性溶液中與KI作用析出碘，然后用硫代硫酸納滴定所析出的碘，來推算糖的含量，進而標定淀粉酶的效價。

電化學分析法——離子選擇性電極分析法：電極借助敏感膜對某一離子產(chǎn)生選擇性的響應。第16頁/共48頁

比色法：樣品與顯色劑可發(fā)生顏色反應，依顏色反應的強度測定含量。

光譜分析法

例：用比色法測定硫酸軟骨素的含量

原理：樣品先用鹽酸水解生成氨基己糖，然后在堿性條件下與乙酰丙酮反應，再與對二甲氨基苯甲醛反應產(chǎn)生紅色，以鹽酸氨基葡萄糖為對照品，用比色法測定。1.樣品配制：a.配制鹽酸氨基葡萄糖對照品溶液；b.配制供試品溶液，水解并中和多余鹽酸；

方法：第17頁/共48頁2.顯色反應：精密量取兩份對照品、供試品溶液，以水作為空白，在堿性條件下與乙酰丙酮反應，再與對二甲氨基苯甲醛進行顯色反應；3.吸光度測定：在525nm的波長處分別測定對照品溶液與供試品溶液的吸收度，以兩份的平均值，按下式計算：A、As分別為樣品和對照品溶液吸收度的平均值；Ws為對照品溶液每lml中含鹽酸氨基葡萄糖的量（mg）；W為供試品重量（mg）；0.8309為氨基葡萄糖與鹽酸氨基葡萄糖分子量的比值。第18頁/共48頁

樣品或轉化后的產(chǎn)物在某一波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內，其濃度與吸收度成正比，則可進行定量測定。

紫外分光光度法

樣品或其衍生物經(jīng)紫外光照射后發(fā)出熒光，利用熒光強度進行定量；或利用衍生化反應和熒光淬滅進行測定。

熒光分光光度法第19頁/共48頁HPLC法：

特點：不破壞樣品，適合分析高沸點、大分子、強極性和熱穩(wěn)定性差的生化藥物，尤其是具有生物活性的物質。

色譜分析法

常用的固定相、流動相、檢測器1．反相高效液相（RP-HPLC）：

主要用于分析肽類、氨基酸、蛋白質和多糖等的定量分析常用的HPLC法包括：第20頁/共48頁2．高效離子交換色譜法（HPIEC）：常用于分離分析蛋白質、多肽；特點：

蛋白質、多肽的分離是根據(jù)其相應的離子化程度而進行的；

分離過程是以鹽濃度增大的梯度洗脫法進行的；

柱效中等但具有較高質量的活性回收。第21頁/共48頁3．高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）可用于多肽和蛋白質等生化藥物分離，并測定分子量。特點：本法填料和樣品間的相互作用在所有的液相色譜技術中，是最溫和的。

在固定比例的水溶液中分離，流動相通常為緩沖液；

分離是根據(jù)蛋白質或多肽在溶液中相應的有效粒徑而進行的。第22頁/共48頁

灌注色譜法：20世紀90年代發(fā)展起來的用于分離純化和分析的色譜新技術。

特點：采用新的分離介質，允許液體傳送流經(jīng)介質的內表面，樣品直接灌注入介質顆粒中，大大消除了傳統(tǒng)色譜分離中擴散速率對分離容量和分辨率的負面影響，提高分離的速度和效率。

應用：基因工程藥物和其它大分子藥物的分離純化和分析第23頁/共48頁

分類：

定義：在電解質溶液中，帶電粒子或離子在電場作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象叫電泳。二、生化測定法

原理：基于溶質在電場中的遷移速度不同而進行的分析方法

電泳法

根據(jù)電泳的分離特點及工作方式，電泳可分為三大類：（l）自由界面電泳：第24頁/共48頁★（2）區(qū)帶電泳：在電泳過程中，應用各種不同的惰性支持介質，在電場作用下，使具有不同泳動速度的組分形成各自區(qū)帶的電泳。紙電泳法；醋酸纖維素薄膜電泳法；聚丙烯酰胺凝膠電泳法；十二烷基硫酸納（SDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳法；（3）高效毛細管電泳：是在一根內徑約50μm的毛細管中，在高壓電場下進行樣品分離分析的一種新型電泳技術。

常用方法：根據(jù)所用的支持物不同可分為：第25頁/共48頁

酶法酶活力測定法酶分析法以酶為分析對象的分析方法以酶為分析工具或分析試劑的分析方法

酶活力測定法酶分析法以酶能夠高效、專一地催化某些化學反應為基礎，通過對酶反應速度的測定或生成物等濃度的測定而檢測相應物質的含量原理：定義：目的：測定某種酶的活力或活性，用酶的活力單位和比活性表示以酶為試劑測定樣品中酶以外的其它物質的含量第26頁/共48頁

酶反應速度用單位時間反應底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示

酶活力測定法1.概念：酶活力：指酶催化一定化學反應的能力酶活力的測定即是測定一個被酶所催化的化學反應的速度A

B

酶第27頁/共48頁2.酶活力評價指標酶的活力單位（enzymaticactivityunit）

酶的比活性（specificactivity）定義：一定條件下，單位時間內轉化一定量底物所需酶的量。酶在25℃以最適當?shù)牡孜餄舛取⒆钸m當?shù)木彌_液離子強度以及最適當?shù)膒H等條件下，每分鐘能轉化1μmol底物的酶量為一個活性單位，用IU表示。定義：每毫克蛋白質中所含的酶單位數(shù)，用IU/（mg

蛋白質）表示每毫克酶的活力單位數(shù)×

在酶高度純凈，酶的分子量已知時，可采用分子活力表示。第28頁/共48頁3.酶促反應的條件及影響因素：使所有待測定的酶分子都應該能夠正常地發(fā)揮它的作用?！锶绾芜x擇酶促反應的條件：?底物濃度影響：反應速率受到底物濃度影響?pH影響：pH影響酶的活性和反應方向[S]＝100KmpH7pH10乳酸丙酮酸如：乳酸脫氫酶第29頁/共48頁?溫度影響：這一影響體現(xiàn)在兩個方面直接影響化學反應速度影響酶通常選用25℃，30℃或37℃（±0.1℃）?輔助因子影響：

有些酶需要金屬離子，有些酶則需要相應的輔酶物質。為了提高酶在反應系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，有時需要某些相應的物質。如對巰基酶可加入二巰基乙醇、二巰基蘇糖醇等。第30頁/共48頁?空白和對照：

通過不加酶，或不加底物，或二者都加（但酶需經(jīng)過失效處理）；

空白是指雜質反應和自發(fā)反應引起的變化量；提供未知因素的影響。

對照是指用純酶或標準酶制劑測得的結果，主要用于比較或標定。第31頁/共48頁ii)常用方法有：適當條件下將酶和底物混合①測定生成一定量產(chǎn)物所需的時間，即終點法②隔一定時間，間斷或連續(xù)地測定反應變化③反應一定時間后停止反應，定量測定底物減少或產(chǎn)物生成的量i)包括物理法、化學法和酶分析法4.測定方法：第32頁/共48頁按取樣和檢測方式分為取樣測定和連續(xù)測定：★取樣測定

酶反應開始后不同的時間，取出一定量反應液，并用適當?shù)姆椒ㄍＶ蛊浞磻螅瑢Ξa(chǎn)物和底物進行定量分析，求得單位時間內酶促反應變化量的方法。加入酶變性劑加熱使酶變性第33頁/共48頁

基于底物和產(chǎn)物在物理化學性質上的不同，在反應過程中對反應系統(tǒng)進行直接連續(xù)檢測的方法?！镞B續(xù)測定②幾乎所有酶反應都可根據(jù)產(chǎn)物或底物的化學性質找出具體測定方法取樣測定法目前仍廣泛采用，這是因為：①它不需要特殊儀器；③由于色源底物和熒光源底物的發(fā)展，可在原來的底物分子上接上相應的有色基團、發(fā)色基團或熒光基團。從準確性和測定效率看，連續(xù)法都比取樣測定好。第34頁/共48頁★檢測方法：常用UV-Vis和熒光分光光度法?UV-Vis分光光度法：?熒光分光光度法如：細胞色素氧化酶的底物為細胞色素C，該物質的還原態(tài)在550nm的摩爾吸收系數(shù)為2.18×104，而氧化態(tài)為0.80×104，可利用這種吸收度差別來進行測定。產(chǎn)物和底物之一有熒光，熒光強度變化可指示反應速度。特別適于酶量或底物量極低時的快速分析。?旋光度法產(chǎn)物和底物在某波長或波段處有明顯的特征吸收差別。某些酶反應過程常伴隨著旋光變化，在沒有其它更好的方法可用時，可考慮用旋光度測定法第35頁/共48頁?其它法酶偶聯(lián)測定、電化學測定、放射化學法等5.計算：測定酶反應速度V(velocity)求酶的濃度或含量C(concentration)V=k·C+b?酶反應進程曲線：不同酶量的產(chǎn)物濃度CB～時間t反應速度Vt檢驗酶反應和測定系統(tǒng)是否正確?酶濃度曲線：反應速度Vt～酶量C第36頁/共48頁例：胃蛋白酶的活力測定原理：胃蛋白酶催化血紅蛋白水解成不被三氯醋酸沉淀的氨基酸，水解的芳香氨基酸如酪氨酸有紫外吸收，用UV分光光度法直接測定，計算酶活力。方法：1.對照品溶液的制備：精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的酪氨酸適量，加鹽酸溶液（取1mol／L鹽酸溶液65mL，加水至1000mL）制成每1mL中含0.5mg的溶液。2.供試品溶液的制備：取本品適量，精密稱定，用上述鹽酸溶液制成每1ml中約含0.2～0.4單位的溶液。第37頁/共48頁

取試管6支，其中3支各精密加入對照品溶液1mL，另3支各精密加入供試品溶液1ml，置37±0.5℃水浴中，保溫5min，精密加入預熱至37±0.5℃的血紅蛋白試液5ml，搖勻，并精確計時，在37±0.5℃水浴中反應10min。立即精密加入5％三氯醋酸溶液5ml，搖勻，濾過，取續(xù)濾液備用。

另取試管2支，各精密加入血紅蛋白試液5ml，置37±0.5℃水浴中保溫10min，再精密加入5％三氯醋酸溶液5ml，其中1支加供試品溶液1ml，另1支加上述鹽酸溶液1ml，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，分別作為供試品和對照品的空白對照，照分光光度法，在275nm的波長處測定吸收度，算出平均值As和A3.測定法：取樣測定空白測定第38頁/共48頁4.計算：

以每分鐘能催化水解血紅蛋白生成1μmol酪氨酸的酶量為一個蛋白酶活力單位，計算每1g含蛋白酶的活力單位：式中：Ws為1mL對照品溶液的酪氨酸含量（μg）；

181.19為酪氨酸的分子量。

W為供試品取樣量（g）；

n為供試品的稀釋倍數(shù)；

A，As為對照品及供試品溶液吸收度的平均值；第39頁/共48頁

酶分析法★

酶分析法是以酶為分析工具或分析試劑的分析方法，分析對象包括酶的底物、輔酶、活化劑和酶的抑制劑等?！锓治鲞^程：選擇“工具酶”酶反應的測定含量濃度測定★方法：?總變量分析法：又稱為平衡法或終點法

僅適用于底物的檢測方法。在酶作用的反應完成后，借助理化方法測定其總變化量，并參考反應的平衡點，計算被測物的實際含量或濃度的一種分析方法。第40頁/共48頁?動力學分析法：討論：1.被測底物的濃度應很小，且反應須控制在一級反應水平；2.其它因素應盡量處于最適水平，雙底物反應的另一底物應具有足夠高的濃度。3.酶的用量要適宜足夠高，以保證反應較快達到終點價格昂貴1～2Km(IU/mL)

原理：通過條件控制，分別使底物、輔酶活化劑或抑制劑的濃度在酶反應中起決定反應速度的主導作用，這時酶反應速度和上述相應因素的濃度間將具有確定的比例關系，這樣測定酶反應的速度就可求出它們的濃度。第41頁/共48頁

方法：酶分析法采用的條件和酶活力測定法的條件基本相同，但其所用的酶量必須一定．被測物以外的其他反應成分均須保證處于恒定和最適。（1）被測物是酶的底物：當?shù)孜餄舛龋跾］<Km時，酶反應相對底物為一級反應，v=k·[S]，因此測定酶反應速度可以得知其濃度。（2）被測物是輔酶（雙底物反應）：需要NAD(P)、CoA之類輔酶的反應可看作是雙底物反應，這些輔酶可看作是底物之一。當另一類底物濃度足夠高時，反應速度將與其濃度成正比。第42頁/共48頁（3）被測物為活化劑：當其他條件最適且一定時，活化劑在低濃度范圍內，酶反應速度隨活化劑濃度增大而升高，并在一定范圍內具有線性比例關系。（4）被測物是抑制劑：不可逆抑制劑對酶反應的抑制程度隨抑制劑濃度呈線性增加，而且酶反應的最終抑制程度由抑制劑的絕對量決定；可逆抑制劑在底物濃度一定時，在低濃度范圍內，酶反應速度隨抑制劑濃度升高呈線性降低。