蛋白質翻譯后修飾

蛋白質翻譯后修飾

Post-translational

modification

陳鵬(perchen@163.com)DepartmentofPathophysiologyKeyLaboratoryofProteomicsofGuangdongProvince,SouthernMedicalUniversity中心法則更豐富，更全面的性狀調控翻譯后修飾磷酸化(phosphorylation)糖基化(glycosylation)甲基化(methylation)乙?；?acetylation)泛素化(ubiquitination)ModulationofsignalingcomplexesProteinposttranslationmodification(PTM)磷酸化指由蛋白質激酶催化的把ATP或GTPγ位的磷酸基轉移到底物蛋白質氨基酸殘基上的過程，是生物體內一種普遍的調節(jié)方式。蛋白激酶催化結構域PKAPKGPKCMLCKPhKCdc2c-Srcv-ErbBEGFR(a)(b)ⅠⅡⅢⅣⅤⅥaⅥbⅦⅧⅨⅩⅪ550250圖5-1蛋白激酶結構示意圖（據(jù)TalorandStone）(一)蛋白激酶的結構(二)蛋白激酶的種類真核細胞的蛋白激酶可分為五類：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，磷酸基團的受體是絲氨酸/蘇氨酸羥基；酪氨酸蛋白激酶，磷酸基團的受體是酪氨酸的酚羥基；組/賴/精氨酸蛋白激酶，磷酸基團的受體是咪唑環(huán)、胍基、氨基；半胱氨酸蛋白激酶，磷酸基團的受體是巰基；天冬氨酸/谷氨酸蛋白激酶，磷酸基團的受體是?；?。酪氨酸激酶非受體型蛋白酪氨酸激酶受體型蛋白酪氨酸激酶Alb家族JAK家族Fak家族Ack家族Fes家族Syk家族Tec家族Src家族Brk家族SrmCsk家族SH3SH2SH1DNA結合區(qū)肌動蛋白結合區(qū)假SH1結構域JH結構域整合素結合區(qū)樁蛋白結合區(qū)Cdc42結合區(qū)PHTHSH4圖5-2不同非受體型蛋白酪氨酸激酶家族的結構EGFRErbB2/neuErbB3INSRIGF-IRIRRPDGF-RPDGF-RM-CSFRSCFR/c-kitFGFR1~4VEGFRFlt,FlkHGFR/MetTrkATrkBTrkCEph,ElkEck,EekErkCek4,Cek5Axl圖5-3受體型蛋白酪氨酸激酶的分類蛋白激酶在信號轉導中的作用蛋白激酶以四種方式參與細胞信號轉導：1．具有激酶活性的受體2．近膜信號分子3．細胞內信號分子4．多聚體形成蛋白激酶間的相互調節(jié)信號轉導級聯(lián)ppp磷酸酶激酶蛋白激酶磷酸化其活性測定經典蛋白激酶活性分析實驗流程以免疫共沉淀法獲得蛋白激酶加入該激酶底物和32-ATP，激酶使底物磷酸化放射自顯影，確定磷酸化條帶以免疫共沉淀法獲得蛋白激酶加入該激酶底物，激酶使底物磷酸化再加入底物磷酸化特異性抗體以PhosphoAb-HRPWestern化學發(fā)光檢測試劑盒測定底物的磷酸化程度，進而推出蛋白激酶活性非放射性蛋白激酶活性分析實驗流程較傳統(tǒng)激酶活性測定方法的優(yōu)點無需接觸放射性物質敏感度高：可以檢測到每個磷酸化分子特異性：利用磷酸化特異性抗體可以進行位點特異性分析信噪比高低背景系統(tǒng)完整：提供一整套直接從細胞裂解液中測試酶活的試劑節(jié)約時間：由幾天降到幾分鐘研究工作MAPK—哺乳動物細胞功能調控的重要信號系統(tǒng):1991年：首先在哺乳動物細胞鑒定出ERK(extra-cellular-signalregulatedproteinkinase)。1993年：JNK(c-Junamino-terminalkinase)/SAPK（stress-activatedproteinkinase）1994年：p38/RK/CSBP1995年：ERK5/BMK1(bigMAPkinase1)MAPK通路的細胞內信號轉導過程MKKKMKKMAPKMEK1/2ERK1/2MEKK1MKK4Raf1JNKs應激炎癥反應生長凋亡生長信號ASK1/MLKMKK3/6p38sLPSMEK5ERK5?H2O2?細胞反應刺激MAPK的作用底物:轉錄因子：

ATF2、c-Jun、Chop10、

MEF2C、ELK1胞內蛋白激酶：MAPKAPK2/3、MNK1/2、

PRAK、MSK1/2骨架相關蛋白：MAPs、Tau、sHSP離子通道蛋白：Na+通道蛋白MAPK介導的細胞反應MAPkinasesProliferationDifferentiationStressresponseApoptosisCellcycleInflammationSurvivalDevelopment細胞炎癥反應時MAPK的激活ERK通路：LPS（lipopolysaccharide）、sPGN(solublepeptidoglycan)等激活；JNK通路：LPS、TNF-和IL-1、紫外線、射線、熱休克、細胞外高滲及DNA變性劑；p38通路：LPS、致炎細胞因子、細菌成分、紫外線照射、高滲、H2O2、熱休克、

EPO和白細胞介素3(IL-3)等；BMK通路：TNF-、H2O2、高滲。MAPK是參與細胞炎癥反應調控的重要信號系統(tǒng)MAPK激活參與炎癥因子的生成LPS通過激活ERK通路而增加TNF的合成。p38激酶特異性抑制劑或ERK通路抑制劑可抑制LPS誘導的單核細胞COX2的生成。TNF-通過激活p38增加MCP-1的表達，這種作用能被p38的特異性抑制劑SB203580所阻斷。p38激活后移位入核后參與了LPS誘導的TNF-基因轉錄表達調控。MAPK通路抑制劑對炎癥反應的抑制作用:

p38MAPK特異性抑制劑，包括SK&F86002、SB206718、SB220025、SB202190和SB203580等。ERK通路抑制劑PD98059能特異性地抑制的上游激酶MEK1，從而具有阻斷ERK通路的作用。Curcumin可明顯抑制多種刺激對JNK的激活作用，能抑制AP-1和NF-kappaB活性。而且JNK對curcumin的敏感性較高，其IC50為5-10M，而對ERK的半量抑制濃度為20M。LPS介導全身炎癥反應綜合征重要而典型的炎癥過程，可導致多器官功能衰竭。LPS誘導的細胞反應是一個公認的細胞信號轉導模型LPS巨噬細胞TNF和其他細胞因子SIRSPAFKininsLeukotrienesROSProteasesNO其他細胞LPS介導的炎癥反應研究取得的重要進展:LBP參與LPS的運輸（Tobias,1986）;CD14參與髓樣細胞激活（Schumann,1990;Wright,1990）；sCD14的參與CD14的實質細胞反應（Pugin,1993）；首次克隆和鑒定了人TLR（Toll-likereceptor）(Medzhitov,1997&1998;Rock,1998)。TLR2通過一種LBP/CD14依賴的通路參與LPS介導的反應，帶來NFB轉錄活性增加(Yang,1998;Kopp,1999)。最近用定位克隆技術（positionalcloning）證明TLR4是介導LPS信號的關鍵受體，控制對LPS的反應的Lps基因編碼鼠TLR4而不是TLR2(Poltorak,1998;Beutler,2000)。糖基化是在酶的控制下，蛋白質附加上糖類的過程，發(fā)生于內質網(wǎng)。在糖基轉移酶作用下將糖轉移至蛋白質，和蛋白質上的氨基酸殘基形成糖苷鍵。蛋白質經過糖基化作用，形成糖蛋白。糖基化蛋白質甲基化一般都是指精氨酸或賴氨酸在蛋白質序列中的甲基化。典型的甲基化發(fā)生在染色質組蛋