基因芯片在腫瘤研究中的應用

腫瘤基因組學與基因芯片第十講基因芯片在腫瘤研究中的應用第1頁腫瘤研究美國1971年頒布國家癌癥條例開始抗癌大戰(zhàn)使癌癥成為“慢性病”基因芯片在腫瘤研究中的應用第2頁ConceptofNeoplasm（瘤）“…isanabnormalmassoftissue,thegrowthofwhichexceedsandisuncoordinatedwiththatofthenormaltissues,andpersistsinthesameexcessivemanneraftercessationofthestimuliwhichevokedthechange”Willis,1952基因芯片在腫瘤研究中的應用第3頁BasicBiologicFeaturesofNeoplasmsOncogenicLesion(e.g.RAS,MYC,E2FActivation)DifferentiationAbnormalProliferationAngiogenesisInvasionSenescenceApoptosis基因芯片在腫瘤研究中的應用第4頁基因芯片在腫瘤研究中的應用第5頁NeoplasmsEvolveinMultipleStepsInitiation:presumablyoccursthroughirreversibleorstabledamagetoDNAPromotion:anprocessbringingaboutaclonalexpansionofinitiatedcellsProgression:resultswhengeneticinstabilityleadstofurthermutagenicandepigeneticchanges基因芯片在腫瘤研究中的應用第6頁腫瘤發(fā)生（Initiation）Tumorinitiation：CooperativeDNAlesionsascommonfinalpathwayPrecancerousandincipient（初始）lesionsMoleculartargets：Oncogenes,tumorsuppressorgenes&DNArepairgenes基因芯片在腫瘤研究中的應用第7頁腫瘤促進（promotion）ExpansionofinitiatedcellsRepetitiveprocess基因芯片在腫瘤研究中的應用第8頁Initiation&Promotion致癌劑腫瘤促進劑低黃曲霉素B1AflaloxinB1，高殺草強Amitrole，砷和其化合物Arsenic&compounds，高三氧化二砷Arsenictrioxide，高三硫化砷Arsenictrisulfide，高石棉Asbestos癌基因（如myc、ras）需要重復刺激基因芯片在腫瘤研究中的應用第9頁Initiation&PromotionTimeNotumorNotumorNotumorNotumorTumorTumor=Promoter=InitiatorGr.1Gr.2Gr.3Gr.4Gr.5Gr.6基因芯片在腫瘤研究中的應用第10頁Initiation&Promotion

TargetGenes基因芯片在腫瘤研究中的應用第11頁腫瘤發(fā)展（progression）腫瘤組織浸潤相鄰組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血道轉(zhuǎn)移遠端轉(zhuǎn)移基因芯片在腫瘤研究中的應用第12頁基因芯片在腫瘤研究中的應用第13頁ApoptosisandTumorigenesis基因芯片在腫瘤研究中的應用第14頁小結(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展三個階段基因芯片在腫瘤研究中的應用第15頁基于基因表示譜分子分型為何提倡利用分子水平進行腫瘤分型？基因芯片在腫瘤研究中的應用第16頁腫瘤普通臨床學知識腫瘤診療腫瘤臨床分期（stage）腫瘤臨床分級（grade）腫瘤治療放療化療輔助治療靶點治療基因芯片在腫瘤研究中的應用第17頁腫瘤臨床分期(stage)TNM分期腫瘤大小(T,tumorsize)腫瘤是否發(fā)生臨近淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N,node)腫瘤是否有遠處轉(zhuǎn)移(M,metastasis)基因芯片在腫瘤研究中的應用第18頁乳腺癌分期TisCarcinomainsiteT1Tumor≤2.0cmingreatestdimensionT2Tumor>2.0cm–5.0cmingreatestdimensionT3Tumor>5.0cmingreatestdimensionT4TumorofanysizewithdirectextensiontochestwallorskinN0NoregionallymphnodesmetastasisN1Metastasistomoveableipsilateralaxillarynode(s)(同側(cè)腋下淋巴結(jié))N2Metastasistoipsilateralaxillarynode(s)fixedtooneanotherorotherstructuresN3Metastasistoipsilateralinternalmammarynode(s)M0NodistantmetastasisM1Distantmetastasis(includesmetastasistoipsilateralsupraclavicular（鎖骨）lymphnode(s)Stage0TisN0M0StageIT1N0M0StageIIaT1N1M0T2N0M0StageIIbT2N1M0T3N0M0StageIIIaT1,2N2M0T3N1,2M0StageIIIbT4AnyNM0AnyTN3M0StageIVAnyTAnyNM1問題：這么分期是否準確反應了病人預后情況？基因芯片在腫瘤研究中的應用第19頁腫瘤臨床分級(grade)分級指標:細胞異常形態(tài)，細胞惡性生長速度。腫瘤細胞生長分級:1到3分別對應級別低，中，高，在臨床上常稱為高分化，中分化，低分化。級別越低，預后越好。級別越高，對放療和化療敏感度也較強。腫瘤細胞與起源器官中細胞相同程度，分化良好細胞有高度特化特點，組織結(jié)構(gòu)清楚，很輕易識別。低分化細胞組織結(jié)構(gòu)不清，極難識別?；蛐酒谀[瘤研究中的應用第20頁腫瘤病理學診療方法冰凍切片和石蠟切片染色和組織化學方法：確定腫瘤細胞分化程度；判別腫瘤類型；研究腫瘤組織發(fā)生流式細胞術定量診療（腫瘤細胞核形態(tài)參數(shù)）：癌（瘤）細胞DNA含量檢測；良性病變多為二倍體；惡性腫瘤多為非整倍體問題：單基因組織化學檢測是否能準確反應腫瘤類型及分化程度？基因芯片在腫瘤研究中的應用第21頁腫瘤傳統(tǒng)檢測傳統(tǒng)腫瘤解剖分期(包含腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目，TNM)對于預測腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移價值不可低估，是臨床上較成熟風險評定指標。傳統(tǒng)組織病理診療：以組織形態(tài)、免疫組織化學染色；通常以單一基因不一樣表現(xiàn)對腫瘤作出診療。問題：組織病理學上看起來一樣腫瘤，其自然發(fā)展史、生物學行為以及對治療反應和預后等都會有所不一樣。從活檢標本上看都象是腫瘤兩個病人，他們都有腫瘤灶，你能夠說它們看起一是一樣，但實際上，一位病人已在別部位有惡性生長了?；蛐酒谀[瘤研究中的應用第22頁腫瘤化療化療對分裂細胞有效，但腫瘤細胞不是體內(nèi)唯一含有分裂能力細胞，所以化療對正常分裂細胞有一定傷害?；蛐酒谀[瘤研究中的應用第23頁腫瘤放療放療對旺盛生長和分裂細胞有效。因為腫瘤細胞比起正常細胞在基因組上不穩(wěn)定，所以對放療敏感度高于正常細胞，同時因為正常細胞含有完善修復系統(tǒng)，比較耐受放療?；蛐酒谀[瘤研究中的應用第24頁腫瘤輔助治療依據(jù)腫瘤特殊性質(zhì)而制訂治療方法，如激素治療也有把放療，化療結(jié)合激素治療方法稱為輔助治療基因芯片在腫瘤研究中的應用第25頁腫瘤靶點治療依據(jù)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中含有主要意義靶點基因而研制成藥品，如乳腺癌治療靶點基因HER2，肺癌靶點基因EGFR基因芯片在腫瘤研究中的應用第26頁腫瘤治療中存在問題放療，化療，激素治療耐受過分治療？基因芯片在腫瘤研究中的應用第27頁基因芯片在腫瘤研究中應用應用DNA微陣列技術和多基因RT-PCR定量檢測方法來預測乳腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移風險及其對治療反應，取得一定突破。還存在諸如檢測方法可重復性、腫瘤標本取材標準、統(tǒng)計學分析以及檢測結(jié)果核查標準化等問題。Ntzani和Ioannides在總結(jié)1995年到4月MEDLINE共84篇關于這類技術論文后發(fā)覺,只有30篇包括臨床結(jié)果,他們提出,DNA微陣列技術還需大規(guī)模前瞻性臨床試驗證實,同時應與現(xiàn)有一些已知預測因子聯(lián)合進行比較,最終作出慎重審核與決定。基因芯片在腫瘤研究中的應用第28頁Stanford大學PatrickBrown認為：有用診療圖譜必定會出現(xiàn)，“當二個生物標本差異足以引發(fā)我們重視時，那么必定在它們基因表示上也有對應差異"

一旦候選基因圖譜被確定，并集中到幾個關鍵基因上，就可利用簡單技術如PCR針對較大人群中對有效、重復產(chǎn)生改變進行檢測。假如一個基因在表示上改變能重復出現(xiàn)，則這個基因就可用作基因診療標識物

基因芯片在腫瘤研究中應用基因芯片在腫瘤研究中的應用第29頁腫瘤生物學指標(包含組織學分級、biomarker、增殖指標等)不但能夠判斷腫瘤預后，還能夠預測腫瘤對治療反應，并為腫瘤個體化治療提供依據(jù)。價值超出了解剖分期，是當前臨床研究方向與重點之一?；蛐酒谀[瘤研究中的應用第30頁腫瘤分子分型（分子診療）腫瘤分級腫瘤分期，預后腫瘤放療化療或激素治療耐受腫瘤靶向轉(zhuǎn)移（腫瘤形成轉(zhuǎn)移能力依賴于各種基因聯(lián)合作用，腫瘤轉(zhuǎn)移每個器官都需要不一樣組基因）。腫瘤分類：用表示圖譜區(qū)分出所檢測標本是正常組織還是腫瘤；若是腫瘤，又能區(qū)分出是良性還是惡性。利用基因芯片得到Biomarker可用于腫瘤早期診療基因芯片在腫瘤研究中應用基因芯片在腫瘤研究中的應用第31頁白血病分類腫瘤分類學在過去30多年間進步不少，不過在判定新腫瘤類型（classdiscovery）和腫瘤分類（cancerclassification）還缺乏通用方法急性白血病分類方法：核形態(tài)學分析，酶學免疫組化，染色體易位分析，任何一個分析都需要非常有經(jīng)驗醫(yī)師進行詳盡檢驗以及分析，需要專業(yè)試驗室來完成，但沒有一個單獨測試能夠足以用于診療傳統(tǒng)分類方法聯(lián)合利用，普通而言比較準確，但依舊會犯錯基因芯片在腫瘤研究中的應用第32頁利用基因芯片表示譜對急性白血病分類尋找在基因表示水平與預測ALL和AML親密相關分子群利用這一分子群，看怎樣能將已知分類樣本進行準確分類預測，即尋找能進行分類基因群（classpredictor）（trainingset）用新樣本群檢測classpredictor準確性(testset)基因芯片在腫瘤研究中的應用第33頁PreciseClassificationofCanceristhe

FirstStepinRationalTreatmentGeneExpressionProfilesScience286:531(1999)Distinguishingbetweenacutelymphoblasticleukemia(ALL)andacutemyeloidleukemia(AML)iscrucialbecausetheirtherapiesaredifferent.RNAfrom38bonemarrowsampleswerehybridizedtoAffymetrixchipscontainingprobesfor6,817genes.Theexpressionprofilesof50genesclearlydifferentiatebetweenthetwotypesofcancer.基因芯片在腫瘤研究中的應用第34頁基因芯片在腫瘤研究中的應用第35頁乳腺癌預后分類與治療同一分期乳腺癌病人在治療反應和總體治療結(jié)果上有很大差異傳統(tǒng)用淋巴結(jié)狀態(tài)和組織化學檢測方法無法準確判斷腫瘤臨床表現(xiàn)化療和激素治療能夠降低遠處轉(zhuǎn)移風險約三分之一70－80％病人不經(jīng)過化療等伎倆預后仍很好基因芯片在腫瘤研究中的應用第36頁GeneExpressionSignaturesforBreastCancerApplication:GeneExpressionIdentifyinggeneexpressionsignaturethatreflectsbiologicalbehaviorofatumor(預后好與預后差)70-geneprognosticprofiletested295breastcancersamplesoutperformedallclinicalvariablesforpredictingpatientsurvivalMicroarrayclassifierstodirectcustomizedtherapyStartingpointfortargetedandrationaldrugdevelopment基因芯片在腫瘤研究中的應用第37頁ClassificationonprognosticsignatureSupervisedclassificationonprognosissignaturesPredictclinicaloutcome基因芯片在腫瘤研究中的應用第38頁Prognosisofadditional19patientsResults

231genesweresignificantlyassociatedwiththediseaseoutcome70geneswerefurtherselectedtobeoptimalmarkergenePredictionaccuracy~80%基因芯片在腫瘤研究中的應用第39頁開發(fā)企業(yè)：Agendia

芯片名稱：MammaPrint(R)

AgendiaReceivesU.S.FDAClearanceForMammaPrintBreastCancerDiagnosticTest

AgendiaannouncedthattheU.S.FoodandDrugAdministration(FDA)hasclearedthecompany'sMammaPrintbreastcancerdiagnostictest.MammaPrintisa

geneexpressionprofilingservicetoassesstheriskofrecurrenceinbreastcancerpatients.MammaPrintrepresentsaU.S.regulatorymilestoneasthefirstInVitroDiagnosticMultivariateIndexAssay(IVDMIA)toacquiremarketclearancefromtheFDA,andistheagency'sfirststeptowardstandardizingthesemulti-geneexpressiontests.

基因芯片在腫瘤研究中的應用第40頁DNA陣列雜交結(jié)果最直接影響是診療；雜交結(jié)果中能夠得到藥品靶標基因，可為最終治療癌癥打下基礎挑戰(zhàn)：伴隨試驗技術及儀器不停改進和基因組數(shù)據(jù)急劇增加，基因芯片產(chǎn)生各種基因表示數(shù)據(jù)，規(guī)模龐大，內(nèi)容復雜；怎樣分析挖掘數(shù)據(jù)成為生物信息學中挑戰(zhàn)性課題。利用芯片檢測腫瘤組織中基因表示譜將成為研究腫瘤一個標準方法?；蛐酒谀[瘤研究中應用基因芯片在腫瘤研究中的應用第41頁小結(jié)當前腫瘤診療和治療中存在問題利用基因芯片進行分子分型基因芯片在腫瘤研究中的應用第42頁其它基因芯片類型在腫瘤研究中應用miRNA芯片CGH芯片甲基化芯片等基因芯片在腫瘤研究中的應用第43頁miRNA芯片基因芯片在腫瘤研究中的應用第44頁microRNA

microRNA(miRNA)是20～24nt單鏈RNA,在進化上含有高度保守性，它經(jīng)過與靶mRNA不完全互補配對，抑制蛋白翻譯,調(diào)整內(nèi)源基因表示，在基因調(diào)控中飾演了主要角色。MicroRNA普通經(jīng)過堿基配對結(jié)合到mRNA3‘非翻譯區(qū)（3’-UTR），從而抑制mRNA翻譯發(fā)揮功效，在細胞分化，生物發(fā)育過程中起到主要作用，而且參加疾病發(fā)生發(fā)展基因芯片在腫瘤研究中的應用第45頁基因芯片在腫瘤研究中的應用第46頁DifferencesinmiRNAModeofAction基因芯片在腫瘤研究中的應用第47頁miRNAmicroRNA在動植物中廣泛并保守存在；microRNA參加廣泛生物學過程，尤其是發(fā)育相關過程和組織特異性維持；microRNA與target基因交叉調(diào)控關系；microRNA表示基因芯片試驗發(fā)覺在癌癥組織中miRNA廣泛失調(diào)；microRNA表示譜能夠?qū)Σ灰粯影┌Y甚至同種癌癥不一樣亞型進行分類?；蛐酒谀[瘤研究中的應用第48頁miRNA在癌癥中作用1.miRNA處于基因組中脆性位點，在癌癥中經(jīng)常缺失或擴增2.miRNA基因所在位點在癌癥中在表觀遺傳層面上被修飾調(diào)控3.miRNA發(fā)生相關基因如Drosha,Dicer在癌癥中表示失調(diào)Remainslargelyamestery!基因芯片在腫瘤研究中的應用第49頁探針寡核苷酸探針SangermirBase7.0中已知Human,Mouse,Rat,Drosophila,C.elegans和zebrafish探針http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml前體和成熟miRNA都能夠設計探針點于芯片上基因芯片在腫瘤研究中的應用第50頁基因芯片在腫瘤研究中的應用第51頁Case1433wasinitiallydiagnosedasERMSbasedonitshistologyandreactivityfordesmin,smoothmuscleactinandCD99，thiscaseclusteredtightlywiththeotherARMSincludedinthestudy.SubsequentdemonstrationofthefusiontranscriptPAX3-FKHRbyreversetranscription(RT)–PCRandsequencinginthissampleconfirmsthatthiscaseisindeedanARMScase5918wasinitiallydiagnosedasaGISTbasedonitsorigininthewallofthecolonandreactivityforCD34.HoweverthiscaseclusteredawayfromtheeightotherGISTsandinsteadclusteredlooselywithPRMS.BothKITandDOG1arehighlyexpressedinthevastmajorityofGIST.Case5918didnothaveimmunoreactivityforKITorDOG1andnomutationswerefoundinKITexon11,themostcommonmutationinGIST.Histologicreviewofthetumorsuggestedanewdiagnosisofdedifferentiatedliposarcoma.27sarcomas,5normalsmoothmuscleand2normalskeletalmuscletissues基因芯片在腫瘤研究中的應用第52頁microRNAexpressionprofilesclassifyhumancancersLeukemiaSolidTumor基因芯片在腫瘤研究中的應用第53頁microRNA表示譜不一致性很高

不一樣試驗室得出microRNA表示譜結(jié)果很不一致：microRNA芯片技術難度和不成熟性。RNA類型：總RNA進行試驗可能同時檢測了成熟miRNA與前體miRNA。假如miRNA成熟受阻，則能夠解釋此矛盾。這暗示，前體miRNA可能含有獨立，還未知功效。使用純化小RNA進行試驗可能會引入錯誤：當前無法測量小RNA在總RNA中百分比情況，假如癌癥與良性組織含有不一樣百分比小RNA，那么純化小RNA試驗前提（一樣量miRNA被純化得出）則會受到根本影響。樣本量對結(jié)果影響基因芯片在腫瘤研究中的應用第54頁PC3cellsweretransducedwithadenoviruseitherencodingp53orcontaininganemptyvector.After48h,smallRNAwascharacterizedwithPCRArrayscontaining376humanmiRNA-specificassays.Theheatmapvisualizesthefold-differencesinmiRNAexpressionuponp53over-expression(red,up-regulatedmiRNA;green,down-regulatedmiRNA;black,nodifference).PCRArraysarethemostreliabletoolsforanalyzingtheexpressionofafocusedpanelofgenes.Each96-wellor384-wellplateincludesSYBRGreen-optimizedprimerassaysforathoroughlyresearchedpanelofrelevant,pathway-ordisease-focusedgenes.PCRArrayscanalsobecustomizedtocontainapanelofgenestailoredtoyourspecificresearchinterests.基因芯片在腫瘤研究中的應用第55頁比較基因組雜交芯片

CGHarray基因芯片在腫瘤研究中的應用第56頁雜合性缺失（lossofheterozygosity）雜合性指同源染色體中不一樣等位基因存在于一個或多個基因位點中現(xiàn)象；野生型拷貝或等位基因發(fā)生缺失就稱為雜合性缺失（LOH），LOH通常是由染色體缺失或重組引發(fā)。絕大多數(shù)人類腫瘤都存在非隨機性染色體片段丟失。雜合性缺失在腫瘤細胞中是一個非經(jīng)常見DNA變異。基因芯片在腫瘤研究中的應用第57頁腫瘤中存在基因擴增經(jīng)過比較腫瘤組織與體細胞組織中野生型和突變DNA比值能夠檢測LOH以及基因擴增；基因芯片在腫瘤研究中的應用第58頁比較基因組雜交（comparativegenomichybridization，CGH）一個分子細胞遺傳學技術，能夠經(jīng)過一個簡單雜交反應檢測出整個基因組DNA拷貝數(shù)改變。主要原理是采取經(jīng)過熒光標識腫瘤基因組DNA和正?；蚪MDNA為探針，與正常人中期染色體標本進行原位雜交，依據(jù)兩種探針熒光信號強度差異找出基因組中DNA增加或缺失區(qū)域。DNAExtraction&LabelHybMetaphaseChromosomeScanImage基因芯片在腫瘤研究中的應用第59頁aCGH(ArrayComparativeGenomicHybridization)比較基因組雜交（簡稱CGH）方法被用來監(jiān)測染色體基因組改變。CGH最突出優(yōu)點在于：經(jīng)過一次試驗就能完成對整個基因組中全部遺傳物質(zhì)增加或丟失分析，試驗所使用DNA能夠是從新鮮凍存組織中提取，也能夠提取自福爾馬林固定石蠟包埋保留材料。CGH主要用于腫瘤細胞染色體DNA片段缺失和增加檢測,同時對其它與染色體拷貝數(shù)改變相關疾病也能進行分析和檢測，如小兒自閉癥，先天性發(fā)育遲緩等一系列遺傳病癥。基因芯片在腫瘤研究中的應用第60頁ArrayCGH就是一個新用于檢測腫瘤細胞染色體拷貝數(shù)改變技術，該項技術能夠經(jīng)過一個簡單雜交反應檢測出整個基因組DNA拷貝數(shù)改變。主要原理是采取經(jīng)過不一樣顏色熒光標識腫瘤基因組DNA和正常基因組DNA與芯片上結(jié)合覆蓋全部人類基因組寡核苷酸探針雜交，依據(jù)雜交后兩種探針熒光信號強度差異找出基因組中DNA增加或缺失區(qū)域。