第三節(jié)多肽和蛋白質(zhì)類藥物的生產(chǎn)演示文稿

第三節(jié)多肽和蛋白質(zhì)類藥物的生產(chǎn)演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共51頁(yè)。優(yōu)選第三節(jié)多肽和蛋白質(zhì)類藥物的生產(chǎn)當(dāng)前2頁(yè)，總共51頁(yè)。當(dāng)前3頁(yè)，總共51頁(yè)。當(dāng)前4頁(yè)，總共51頁(yè)。1.干擾素概述干擾素的種類干擾素的理化性質(zhì)干擾素的生物學(xué)活性干擾素的臨床應(yīng)用干擾素的生產(chǎn)工藝路線當(dāng)前5頁(yè)，總共51頁(yè)。1.1干擾素的種類概念：（interferon，IFN）干擾素是一種細(xì)胞因子，它是機(jī)體感染病毒時(shí)，宿主細(xì)胞通過(guò)抗病毒應(yīng)答反應(yīng)，而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能相近的低分子糖蛋白。英文名稱為Interferon，簡(jiǎn)稱IFN。發(fā)現(xiàn)：干擾素是1957年英國(guó)科學(xué)家Isaccs等發(fā)現(xiàn)的。他們把滅活的流感病毒作用于小雞細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞產(chǎn)生了一種可溶性物質(zhì)，這種物質(zhì)能抑制流感病毒，并且能干擾其它病毒的繁殖，因此，他們將這種物質(zhì)稱為“干擾素”。以后科學(xué)家們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，機(jī)體對(duì)入侵的異種核酸（包括病毒）都產(chǎn)生干擾素以進(jìn)行防御。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞受到病毒感染時(shí)，機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，干擾病毒復(fù)制，它是機(jī)體抗病毒感染的防御系統(tǒng)。

當(dāng)前6頁(yè)，總共51頁(yè)。天然干擾素分類1.根據(jù)來(lái)源、基因序列和氨基酸組成分類

I型干擾素：

IFNα、IFNβ、IFNτ、IFN

ω

來(lái)源：白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、病毒感染的組織細(xì)胞等

功能：抗病毒感染、抗腫瘤生長(zhǎng)

免疫調(diào)節(jié)(較弱）

其中IFN-α為多基因產(chǎn)物，有23種以上的亞型。

II型干擾素：干擾素γ（IFN)

來(lái)源：活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生

功能：免疫調(diào)節(jié)提高單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原提呈能力增強(qiáng)Tc細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷活性抑制TH2細(xì)胞形成，下調(diào)體液免疫應(yīng)答趨化作用抗病毒和抗腫瘤作用（次要）2.根據(jù)動(dòng)物來(lái)源確定分類，例如人干擾素（HuIFN），小鼠干擾素（MuIFN）。

當(dāng)前7頁(yè)，總共51頁(yè)。上市重組干擾素:α2a、α2b、α1b、β1b，γ1992年我國(guó)第一個(gè)基因工程藥物IFN-α1b獲得國(guó)家一類新藥證書(shū)。研發(fā)中的重組干擾素：IFNω，臨床階段當(dāng)前8頁(yè)，總共51頁(yè)。1.2干擾素的理化性質(zhì)143-166aa；MW:18-40ku；；乙醚、氯仿敏感容易吸附玻璃、淀粉、醋酸纖維膜、瓊脂和塑料等介質(zhì)。當(dāng)前9頁(yè)，總共51頁(yè)。Ⅰ型干擾素具有廣譜的抗病毒活性，對(duì)多種病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用；但這種效應(yīng)不是直接的，而是通過(guò)對(duì)宿主細(xì)胞的作用引起的。①對(duì)干擾素敏感的細(xì)胞表面存在于干擾素受體，核內(nèi)有“抗病毒蛋白”基因，受干擾素作用后該基因活化，產(chǎn)生的抗病毒蛋白可阻止病毒mRNA翻譯，并促進(jìn)病毒mRNA降解。②干擾素能提高細(xì)胞表面MHCⅠ類分子的表達(dá)水平，受到病毒感染的細(xì)胞表面MHCⅠ類分子的增加有助于向Tc細(xì)胞遞呈抗原，引起靶細(xì)胞的溶解。③干擾素可增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)病毒感染的殺傷能力。1.3干擾素的生物學(xué)活性正常情況下組織或血清中不含干擾素，只有在某些特定因素的作用下才能誘使細(xì)胞產(chǎn)生干擾素。廣譜抗病毒活性機(jī)制當(dāng)前10頁(yè)，總共51頁(yè)。病毒復(fù)制抑制病毒復(fù)制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)IFN-aIFN-誘導(dǎo)蛋白誘導(dǎo)刺激胞核胞核當(dāng)前11頁(yè)，總共51頁(yè)。抗腫瘤作用機(jī)制Ⅰ型干擾素能抑制細(xì)胞的DNA合成，減慢細(xì)胞的有絲分裂速度；這種抑制作用有明顯的選擇性，對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用比對(duì)正常細(xì)胞的作用強(qiáng)

500～1000倍。另外，Ⅱ型干擾素也可通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)制、加強(qiáng)免疫監(jiān)督功能來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤效應(yīng)。當(dāng)前12頁(yè)，總共51頁(yè)。免疫調(diào)節(jié)活性機(jī)制

免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在對(duì)宿主免疫細(xì)胞活性的影響，如對(duì)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等均有一定作用。對(duì)巨噬細(xì)胞的作用：IFNγ可使巨噬細(xì)胞表面MHCⅡ類分子的表達(dá)增加，增強(qiáng)其抗原遞呈能力；此外還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞表面表達(dá)Fc受體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬免疫復(fù)合物、抗體包被的病原體和腫瘤細(xì)胞。對(duì)淋巴細(xì)胞的作用：干擾素對(duì)淋巴細(xì)胞的作用較為復(fù)雜，可受劑量和時(shí)間等因素的影響而產(chǎn)生不同的效應(yīng)。在抗原致敏之前使用大劑量干擾素或?qū)⒏蓴_素與抗原同時(shí)投入會(huì)產(chǎn)生明顯的免疫抑制作用；而低劑量干擾素或在抗原致敏之后加入干擾素則能產(chǎn)生免疫增強(qiáng)的效果。在適宜的條件下，IFNγ對(duì)B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的分化有促進(jìn)作用，但不能促進(jìn)其增殖。IFNγ能增強(qiáng)TH1細(xì)胞的活性，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能；但對(duì)TH2細(xì)胞的增殖有抑制作用，因此抑制體液免疫功能。IFNγ不僅抑制TH2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，而且抑制IL-4對(duì)B細(xì)胞的作用，特別是抑制B細(xì)胞生成IgE。對(duì)其它細(xì)胞的作用：IFNγ對(duì)其他細(xì)胞也有廣泛影響：①刺激中性粒細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬能力；②活化NK細(xì)胞，增強(qiáng)其細(xì)胞毒作用；③使某些正常不表達(dá)MHCⅡ類分子的細(xì)胞（如血管內(nèi)皮細(xì)胞、某些上皮細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞）表達(dá)MHCⅡ類分子，發(fā)揮抗原遞呈作用；④使靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)中性粒細(xì)胞的粘附能力更強(qiáng)，且可分化為高內(nèi)皮靜脈，吸引循環(huán)的淋巴細(xì)胞。當(dāng)前13頁(yè)，總共51頁(yè)。1.4重組干擾素的臨床應(yīng)用廣譜抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。直接抗腫瘤活性（rhuIFNα）毛細(xì)胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫調(diào)節(jié)活性——治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFNγ）多發(fā)性硬化癥rhuIFNβ當(dāng)前14頁(yè)，總共51頁(yè)。1.5.干擾素生產(chǎn)工藝路線（1）體外誘生干擾素制備工藝：

Sendai病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞1989年：IFNα-n3/Alferon，批準(zhǔn)上市產(chǎn)量低：1gIFNα，需要3億ml人血白細(xì)胞來(lái)源困難，工藝復(fù)雜，收率低，價(jià)格昂貴潛在的血源性病毒污染的可能性當(dāng)前15頁(yè)，總共51頁(yè)。干擾素生產(chǎn)工藝路線（2）人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：

1999年：IFNα-n1/Wellferon,批準(zhǔn)用于臨床。優(yōu)點(diǎn)：首次實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。缺點(diǎn)：活性低，退出臨床應(yīng)用。當(dāng)前16頁(yè)，總共51頁(yè)。干擾素生產(chǎn)工藝路線（3）上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；

1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；

2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys

表達(dá)產(chǎn)物：無(wú)糖基化，N-met，無(wú)活性包涵體工藝特點(diǎn)：發(fā)酵過(guò)程，隨后變性、復(fù)性過(guò)程。基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:當(dāng)前17頁(yè)，總共51頁(yè)。干擾素生產(chǎn)工藝路線（4）上市產(chǎn)品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；

2002，Rebif(Serono)表達(dá)產(chǎn)物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工藝特點(diǎn)：分泌表達(dá)，產(chǎn)量低，成本高,過(guò)程嚴(yán)格動(dòng)物無(wú)限細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：當(dāng)前18頁(yè)，總共51頁(yè)。干擾素生產(chǎn)工藝路線（5）?宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonasputida）?上市產(chǎn)品：IFNα-2b/安福隆?表達(dá)產(chǎn)物：無(wú)糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子結(jié)構(gòu)和生物活性?工藝特點(diǎn)：發(fā)酵周期短：幾個(gè)小時(shí)無(wú)需變性、復(fù)性過(guò)程，獲得有活性產(chǎn)品純化過(guò)程：淘汰抗體親和層析基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝當(dāng)前19頁(yè)，總共51頁(yè)。2.基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏

基因工程假單胞桿菌菌種建立基因工程假單胞桿菌菌種特性菌種庫(kù)的建立與保藏當(dāng)前20頁(yè)，總共51頁(yè)。2.1、基因工程假單胞桿菌菌種建立第一步：干擾素α-2b基因的克隆第二步：表達(dá)載體的構(gòu)建第三步：工程菌的構(gòu)建當(dāng)前21頁(yè)，總共51頁(yè)。第一步：干擾素基因的克隆(RT-PCR)

制備白細(xì)胞，病毒誘導(dǎo)，分離mRNA,反錄酶合成cDNA,PCR，基因連接質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coli,篩選鑒定克隆。測(cè)序：編碼人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。當(dāng)前22頁(yè)，總共51頁(yè)。第二步：表達(dá)載體構(gòu)建?IFN基因與表達(dá)載體連接?轉(zhuǎn)化大腸桿菌?篩選陽(yáng)性克隆?獲得序列正確表達(dá)載體當(dāng)前23頁(yè)，總共51頁(yè)。第三步：工程菌構(gòu)建轉(zhuǎn)化假單胞桿篩選高表達(dá)、穩(wěn)定遺傳的工程菌獲得原始菌種當(dāng)前24頁(yè)，總共51頁(yè)。2.2基因工程菌的特性（1）具有宿主菌的特征：細(xì)菌：革蘭氏陰性菌，有莢膜，無(wú)芽孢，桿狀。菌落：直徑2.5-3.0mm，灰綠色半透明狀,粘稠。生化特性:Ser-，L-Val、D/L-Arg和L-Thr為（2）工程菌的特征：SmR、TcR、ApR（3）具有生產(chǎn)干擾素能力：放射性免疫學(xué)效價(jià)不低于2.0×109IU/L。當(dāng)前25頁(yè)，總共51頁(yè)。2.3菌種庫(kù)的建立與保藏?QC：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性?菌種檢查合格后，方可投產(chǎn)。當(dāng)前26頁(yè)，總共51頁(yè)。

3.干擾素α-2b的發(fā)酵工藝過(guò)程當(dāng)前27頁(yè)，總共51頁(yè)。3.1搖瓶培養(yǎng)取保存工作種子批菌種，室溫融化搖瓶培養(yǎng)：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h檢測(cè)：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。當(dāng)前28頁(yè)，總共51頁(yè)。3.2種子罐培養(yǎng)

接種：接入50L種子罐，接種量10%。培養(yǎng)：30℃，pH7.0。控制：級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速DO為30%，3～4h，OD>4.0。檢測(cè)：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。當(dāng)前29頁(yè)，總共51頁(yè)。

3.3發(fā)酵罐培養(yǎng)接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%?？刂疲杭?jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。前4h：30℃，pH7.0，DO為30%。4h后：20℃，pH6.0，DO為60%，5～6.5h。終點(diǎn)控制：OD值達(dá)9.0±1.0，5℃冷卻水快速降溫至15℃以下。檢測(cè)：發(fā)酵液雜菌檢查當(dāng)前30頁(yè)，總共51頁(yè)。3.4．菌體收集連續(xù)流離心機(jī)：冷卻的發(fā)酵液，16000r/min離心收集。菌體保存：－20℃冰柜，不超過(guò)12個(gè)月。檢測(cè)：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。當(dāng)前31頁(yè)，總共51頁(yè)。4干擾素的分離純化工藝過(guò)程4.1、干擾素分離工藝過(guò)程

4.2、干擾素的純化工藝過(guò)程當(dāng)前32頁(yè)，總共51頁(yè)。4.1干擾素α-2b分離工藝過(guò)程菌體裂解預(yù)處理初級(jí)分離當(dāng)前33頁(yè)，總共51頁(yè)。(1)菌體裂解

裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保護(hù)劑：EDTA，PMSF（苯甲基磺酰氟）。破碎－20℃菌體：2厘米以下的碎塊攪拌：加裂解緩沖液，2℃～10℃，2hr凍融:細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。當(dāng)前34頁(yè)，總共51頁(yè)。(2)預(yù)處理-沉淀加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌45min，對(duì)菌體碎片進(jìn)行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌15min，對(duì)菌體碎片、DNA等進(jìn)行沉淀。當(dāng)前35頁(yè)，總共51頁(yè)。(3)離心

連續(xù)流離心機(jī)：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì)雜質(zhì)沉淀：121℃、30min蒸汽滅菌,焚燒處理。當(dāng)前36頁(yè)，總共51頁(yè)。（4）初級(jí)分離

鹽析:4M硫酸銨，2℃～10℃，攪勻,靜置過(guò)夜。離心：連續(xù)流離心機(jī)，16000r/min保存：收集沉淀，粗干擾素，4℃保存。當(dāng)前37頁(yè)，總共51頁(yè)。4.2、干擾素純化工藝過(guò)程溶解粗干擾素沉淀與疏水層析陰離子交換層析與濃縮陽(yáng)離子交換層析與濃縮凝膠過(guò)濾層析無(wú)菌過(guò)濾分裝當(dāng)前38頁(yè)，總共51頁(yè)。(1)溶解粗干擾素

配制純化緩沖液：超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45μm濾器和10ku超濾系統(tǒng)，百級(jí)層流下收集。冷卻至2℃～10℃。檢查:緩沖液的pH值和電導(dǎo)值。溶解：

2℃～10℃，勻漿，完全溶解。當(dāng)前39頁(yè)，總共51頁(yè)。(2)沉淀與疏水層析

等電點(diǎn)沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中

除非疏水性蛋白洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）。當(dāng)前40頁(yè)，總共51頁(yè)。等電點(diǎn)沉淀（2）：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導(dǎo)值40ms/cm，2℃～10℃，靜置過(guò)夜超濾：1000ku超濾膜過(guò)濾，除去大蛋白。透析除鹽：調(diào)整溶液pH8.0，電導(dǎo)值，10ku超濾膜，0.005M緩沖液。當(dāng)前41頁(yè)，總共51頁(yè)。(3)陰離子交換層析與濃縮0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）平衡樹(shù)脂。鹽濃度線性梯度5～50ms/cm進(jìn)行洗脫，配合SDS收集干擾素峰。濃縮：調(diào)整溶液和電導(dǎo)，10ku超濾膜，0.05M醋酸緩沖液（pH5.0）中透析。當(dāng)前42頁(yè)，總共51頁(yè)。（4)陽(yáng)離子交換層析與濃縮用0.1M醋酸緩沖液（pH5.0）平衡樹(shù)脂。上樣，相同緩沖液沖洗。鹽濃度線性梯度5～50ms/cm進(jìn)行洗脫配合SDS收集干擾素峰。濃縮：10ku超濾膜進(jìn)行。當(dāng)前43頁(yè)，總共51頁(yè)。(5)凝膠過(guò)濾層析洗滌液：0.15MNaCl的0.01M磷酸緩沖液（pH7.0）清洗系統(tǒng)和樹(shù)脂上樣，相同緩沖液進(jìn)行洗脫。合并干擾素部分當(dāng)前44頁(yè)