高分辨率溶解曲線(xiàn)HRM

高分辨率溶解曲線(xiàn)HRM第一頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日高分辨率熔解曲線(xiàn)(highresolutionmelting)是在實(shí)時(shí)熒光PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的實(shí)時(shí)定量新技術(shù)。常規(guī)Real-timePCR利用SYBRGreen染料標(biāo)記DNA雙鏈，但是SYBRGreen是一種大分子即不飽和染料，不能保證PCR產(chǎn)物全部的小溝都嵌合上SYBRGreen，并且嵌合到產(chǎn)物中的染料如果在擴(kuò)增過(guò)程中不能及時(shí)脫落，還會(huì)抑制PCR反應(yīng)。HRM采用新型的飽和染料如LCGreen，SYTO9等。不僅沒(méi)有不飽和染料的缺點(diǎn)，而且更易于檢測(cè)單堿基突變、小片段插入或缺失。第二頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日第三頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日方法在PCR反應(yīng)前將LCGreen飽和熒光染料與PCR反應(yīng)體系混合，然后將PCR產(chǎn)物直接放入LightScanner、HR-1或Rotor-Gene6000儀器中，在一定的溫度范圍內(nèi)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性，就是對(duì)PCR的擴(kuò)增子進(jìn)行加熱，溫度從50°C逐漸上升到95°C。在此過(guò)程中，擴(kuò)增子逐漸解鏈。在HRM分析的初期，熒光強(qiáng)度很高，隨著溫度升高，雙鏈DNA逐漸減少，熒光強(qiáng)度也就下降了。HRM儀器通過(guò)照相機(jī)，記錄下熒光變化的整個(gè)過(guò)程。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的作圖，就生成了熔解曲線(xiàn)。第四頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日第五頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日第六頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日原理HRM是通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)升溫過(guò)程中雙鏈DNA熒光染料與PCR產(chǎn)物的結(jié)合情況。SNP位點(diǎn)堿基不同會(huì)使雙鏈DNA的TM值發(fā)生變化從而雙鏈DNA在升溫過(guò)程中先后解開(kāi)，形成不同的融解曲線(xiàn)形狀，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，從熒光強(qiáng)度與時(shí)間曲線(xiàn)上就可以判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點(diǎn)、雜合子與純合子等都會(huì)影響熔解曲線(xiàn)的峰形，因此HRM分析能夠有效區(qū)分不同SNP位點(diǎn)與不同基因型。第七頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日第八頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日條件要求1、高分辨率：擴(kuò)增子的熔解曲線(xiàn)完全取決于DNA堿基序列。序列中如有一個(gè)堿基發(fā)生了突變，都會(huì)改變DNA鏈的解鏈溫度。但是這個(gè)差異極小，只有零點(diǎn)幾攝氏度，如果儀器的分辨率不高，是根本無(wú)法檢測(cè)的。那么什么樣的分辨率才是高分辨率呢？根據(jù)儀器現(xiàn)有的功能測(cè)試，在熔解操作時(shí)每攝氏度至少要獲得10個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，這是對(duì)儀器的最低要求。此外，溫度均一性也同樣重要。如果兩孔之間溫度相差0.1°C，就很可能導(dǎo)致最終的熔解溫度相差0.1°C，這樣就無(wú)法保證HRM分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。2、飽和染料：為什么要飽和染料呢？因?yàn)轱柡腿玖巷柡土薉NA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝，在DNA解鏈過(guò)程中就不會(huì)發(fā)生重排，熒光信號(hào)能準(zhǔn)確的反映DNA的解鏈。這樣熔解曲線(xiàn)才有了更高的分辨率。第九頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日HRM在分子診斷中的應(yīng)用基因分型突變掃描甲基化分析序列配對(duì)第十頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日基因分型

傳統(tǒng)的基因分型方法或者耗時(shí)費(fèi)力，或者需要購(gòu)買(mǎi)價(jià)格不菲的探針。HRM分析無(wú)需制備探針；有了飽和染料，PCR產(chǎn)物全程被標(biāo)記，因此所有的熔解區(qū)域都能檢測(cè)到。對(duì)于同一擴(kuò)增子內(nèi)的不同雜合體，通過(guò)曲線(xiàn)形狀的差異也能區(qū)分開(kāi)。HRM已經(jīng)在人類(lèi)(雙倍體)和微生物(單倍體)的基因分型中得到應(yīng)用．人類(lèi)疾病基因包括球蛋白、囊腫性纖維化、V因子、凝血素、血色沉著病蛋白、血小板抗原、乳糖分解酵素和MGMT啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化．微生物基岡有：hsp65、16srRNA基因、gyrA等．

第十一頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日SNP相關(guān)研究方法比較：目前突變/SNP的研究手段大致有三大類(lèi)，一類(lèi)是以熒光共振能量傳遞為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，比如Taqman探針?lè)?。顯著特點(diǎn)是速度快，通量大。缺點(diǎn)是只能檢測(cè)已知SNP，昂貴。第十二頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日第二類(lèi)是酶切。步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)，檢測(cè)已知SNP。結(jié)果不穩(wěn)定。第三類(lèi)方法中包括測(cè)序、Pyrosequencing等技術(shù)。此外還有芯片等技術(shù)可用于SNP分析；Pyrosequencing技術(shù)它既可進(jìn)行DNA序列分析，又可進(jìn)行基于序列分析的SNP檢測(cè)及表觀遺傳學(xué)甲基化的分析以及大規(guī)模的等位基因頻率測(cè)定。第十三頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日HRM主要特點(diǎn)高分辨率溶解曲線(xiàn)（高分辨溶解曲線(xiàn)突變檢測(cè)）是理想的SNP檢測(cè)手段：

快速、高通量—LightScanner5分鐘完成96/384孔板的PCR產(chǎn)物檢測(cè)，20000個(gè)SNP/天

準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性好—LightScanner100%準(zhǔn)確性、特異性（<400bp）；準(zhǔn)確性96.4%和特異性99.1%（400~1kb）

重復(fù)性好—LightScanner重復(fù)性100%

費(fèi)用低—LightScanner檢測(cè)SNP每個(gè)樣品的成本為1RMB

操作簡(jiǎn)便—LightScanner只需將PCR產(chǎn)物（96/384孔板）放入儀器內(nèi)便可，軟件自動(dòng)基因分型第十四頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日第十五頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日第十六頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日突變掃描

目前應(yīng)用HRM進(jìn)行突變掃描的基因有：C-kit、乙酰輔酶A脫酶的中鏈、原肉毒堿缺乏癥、RET、表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR、K—ras、苯丙氨酸羥化酶、p53、HER2、囊腫性纖維化基因的幾個(gè)外顯子等等．第十七頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日第十八頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日第十九頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日甲基化分析

HRM分析還為DNA甲基化狀態(tài)的檢測(cè)另辟蹊徑。DNA樣品通過(guò)亞硫酸氫鹽的處理，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。這樣，原先未甲基化模板所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物比甲基化模板的Tm要低。第二十頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日NucleicAcidsResearch,2009,Vol.37,No.12第二十一頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日序列配對(duì)

有些研究并不需要完全的基因型。而只需知道DNA序列是否匹配，例如：組織移植、基因型．表型的相關(guān)性和辯證性．在活器官移植中。需要對(duì)HLA進(jìn)行基因分型．這個(gè)主要牽涉到HLA-A，B，C和DR等幾個(gè)位點(diǎn)．當(dāng)兩個(gè)個(gè)體的熔解曲線(xiàn)完全相同時(shí)就說(shuō)明HLA基因型完全匹配．第二十二頁(yè)，共二十四頁(yè)，2022年，8月28日HRM新技術(shù)的介紹1、未標(biāo)記探針HRM在HMR的基礎(chǔ)上發(fā)明一種不帶熒光標(biāo)記的探針，由原來(lái)的單一擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)模式轉(zhuǎn)變?yōu)橛蓴U(kuò)增產(chǎn)物與探針兩部分組成的模式。2、彈回探針彈回探針(snapbackprimer)是在引物末端加一個(gè)與靶片段的突變區(qū)域互補(bǔ)的尾巴序列，反應(yīng)體系是不對(duì)稱(chēng)PCR(asymmetricPCR)，帶有彈回探針的引物為過(guò)剩引物(excessprimer，EP)，另一條引物為限制引物(1imitingprimer，LP)。