農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化

第六章病毒純化利用各種物理、化學(xué)方法，以不使病毒受損傷和失活為前提，去除宿主細(xì)胞組分等非病毒雜質(zhì)，提取出高純度濃縮病毒樣品。病毒微細(xì)結(jié)構(gòu)研究病毒抗原蛋白分離純化病毒化學(xué)成份及其遺傳物質(zhì)研究病毒感染分子細(xì)節(jié)研究農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第1頁一、病毒純化標(biāo)準(zhǔn)保持感染性含有均一性：結(jié)晶形成檢測病毒制備物均一性方法：電鏡觀察：大小、形態(tài)均一超速離心：沉降速率和密度一致，只出現(xiàn)一條沉降帶電泳：顆粒大小及表面電荷均一，只形成一條電泳帶免疫學(xué)方法：只與特異性抗體發(fā)生反應(yīng)大小、形態(tài)、密度、化學(xué)組成、分子量、抗原性農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第2頁二、病毒純化理論依據(jù)病毒體外表面主要化學(xué)組成是蛋白質(zhì)，可利用蛋白質(zhì)提純方法純化病毒病毒體含有一定大小、形狀和密度，可利用超速離心技術(shù)提純病毒農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第3頁三、病毒純化前預(yù)處理1、病毒感染組織、臟器或細(xì)胞研磨勻漿超聲波處理重復(fù)凍融低速離心去掉細(xì)胞碎片2、細(xì)胞培養(yǎng)液、雞胚尿囊液低速離心去掉可能含有雜質(zhì)或直接用于病毒分離純化農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第4頁沉淀法超速離心法超濾法層析法兩相溶劑間分配系數(shù)法吸附法電泳法四、病毒純化方法農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第5頁（一）沉淀法主要從稀病毒懸浮液中濃縮病毒。中性鹽沉淀法（鹽析）聚乙二醇沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法皂土法魚精蛋白沉淀法農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第6頁1、中性鹽沉淀法（鹽析）先用其它方法去除材料中大量雜質(zhì)，再以高濃度中性鹽溶液鹽析，析出沉淀用緩沖液懸浮后再進(jìn)行鹽析，重復(fù)幾次后，懸浮沉淀，用透析法或其它方法脫鹽。病毒普通在45%以上飽和度硫酸銨溶液中沉淀，且保持感染性。農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第7頁2、聚乙二醇（PEG）沉淀法用于病毒沉淀分子量：-6000將PEG配成50%左右溶液，或直接將固體PEG加于病毒懸液中，使其到達(dá)所需濃度，在4℃攪拌過夜，然后離心使病毒沉淀。農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第8頁3、有機(jī)溶劑沉淀法乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物原理：A、降低溶液介電常數(shù)，從而增加病毒顆粒表面不一樣電荷之間引力，造成其溶解度降低。B、與水作用，破壞蛋白質(zhì)分子水化膜。優(yōu)點(diǎn)：分辨力高，易除去缺點(diǎn)：易使表面蛋白質(zhì)變性，溶解脂質(zhì)農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第9頁4、等電點(diǎn)沉淀法（分辨力不高）原理：病毒粒子在等電點(diǎn)時(shí)，所攜帶正電荷與負(fù)電荷相互中和，因而失去相互排斥作用而發(fā)生沉淀（分辨力不高）。多數(shù)病毒等電點(diǎn)在pH4.０~5.5之間。農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第10頁5、皂土法輪狀病毒皂土在酸性條件下（pH4~4.5)可吸附輪狀病毒，在堿性條件下(pH8.5)，又使其洗脫下來。農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第11頁6、魚精蛋白沉淀法（沉淀直徑大于50nm病毒）魚精蛋白為堿性蛋白，含有攜帶其它蛋白質(zhì)（直徑大于50nm）共沉淀作用，當(dāng)向這種沉淀物加入1mol/LNaCl時(shí)，其它蛋白質(zhì)又重新釋放到懸液中，而魚精蛋白依然沉淀。農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第12頁（二）層析法葡聚糖柱層析法凝膠層析法離子交換柱層析法親和層析法農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第13頁（三）兩相溶劑間分配系數(shù)法原理：溶質(zhì)在兩個(gè)互不相溶溶劑中分配系數(shù)不一樣而選擇性地分配于其中一方。慣用溶劑：葡聚糖硫酸鹽（dextransulphate,Ds)聚乙二醇（PEG）甲基纖維素（MC）聚乙烯醇（PVA）分配體系：Ds-PEG系、Ds-PVA系、Ds-MC系農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第14頁（四）吸附法原理：利用對病毒或?qū)﹄s質(zhì)有選擇吸附能力固體吸附劑吸附病毒或吸附雜質(zhì)，再用一定鹽溶液把它們洗脫下來。

作為吸附劑必須具備特點(diǎn)：有較大表面積和吸附能力較高吸附選擇性便于洗脫性質(zhì)穩(wěn)定農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第15頁慣用吸附劑：白土磷酸鈣硅藻土紅細(xì)胞離子交換樹脂羧甲基纖維素農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第16頁（六）超濾法利用超濾膜將水、鹽及小分子濾過，將一定大小大分子或病毒等顆粒截住從而使后者得到濃縮。優(yōu)點(diǎn)：可用于大容量樣品濃縮能夠在室溫或低溫下操作對被濃縮產(chǎn)物損害小濃縮同時(shí)可到達(dá)部分純化回收率高可預(yù)防外來污染（五）電泳法農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第17頁（七）離心法差速離心速度區(qū)帶離心法密度梯度離心農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第18頁1.差速離心法原理：不一樣大小和比重粒子沉降速度不一樣。用途：從組織培養(yǎng)液、雞胚尿囊液或經(jīng)過紅細(xì)胞吸附釋放病毒懸液中提純病毒。優(yōu)點(diǎn)：可快速處理大量樣品步驟：低速（-3000r/min,20-30min)、中速（10000min,20-30min)去除較大宿主細(xì)胞碎片、污染細(xì)菌及其它較大雜質(zhì)。再選擇較高速度離心1-2h使病毒沉淀。農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第19頁速度梯度離心法密度梯度離心法原理沉降與顆粒質(zhì)量成正比，以物質(zhì)沉降速度不一樣進(jìn)行分離沉降與顆粒密度成正比，以物質(zhì)浮密度不一樣進(jìn)行分離介質(zhì)密度小，1-1.3286，預(yù)制梯度，不連續(xù)密度大，1-1.9025，連續(xù)梯度離心力場強(qiáng)，離心速度高，使被分離物質(zhì)易沉降稍強(qiáng)，速度相對低，使CsCl形成梯度，建立沉降擴(kuò)散平衡離心過程樣品向離心管底沉降樣品停留于介質(zhì)等密度部位離心時(shí)間較短，幾小時(shí)到幾十小時(shí)較長，十幾小時(shí)到數(shù)天2.速度梯度離心法與密度梯度離心法農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第20頁速度梯度離心密度梯度離心…………AB農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第21頁五、病毒純化應(yīng)注意問題1、保持病毒感染性嚴(yán)格控制溫度、pH及試劑選擇。2、選取適宜純化試驗(yàn)起始材料無其它病毒或毒株污染病毒體含量高雜質(zhì)含量少并易于處理農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第22頁3、依據(jù)詳細(xì)情況選擇提純方法依據(jù)需要純化病毒性質(zhì)、起始材料特點(diǎn)、研究目標(biāo)以及試驗(yàn)室條件等，選擇適宜純化方法。4、建立靈敏病毒判定和測定方法農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第23頁六、偽狂犬病毒濃縮提純1、病毒材料將偽狂犬病病毒接種于PK-15細(xì)胞，病變后搜集細(xì)胞培養(yǎng)物，重復(fù)凍融3次，即為樣品材料。農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第24頁2．病毒提純濃縮去細(xì)胞碎片及雜質(zhì)：將細(xì)胞培養(yǎng)物4℃3000r/min離心30min，搜集上清液。硫酸銨沉淀：按100ml病毒液42.5g硫酸銨量加入硫酸銨，攪勻后置4℃冰箱攪拌沉淀過夜，4℃5000r/min離心40min，去上清，沉淀用適量滅菌ddH2O懸浮。透析：將懸浮病毒液裝于透析袋中，于ddH2O或PBS中攪拌透析，每半個(gè)小時(shí)換一次液，共換5次，第5次透析過夜。農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第25頁濃縮：透析完成后，取出，用聚乙二醇或蔗糖將病毒濃縮至適當(dāng)體積。超離純化：在離心管中加入不一樣濃度甘油墊層，即先加入45%甘油，再加入5%甘油。加入病毒懸液（應(yīng)不超出離心管總?cè)莘e10%）。0-25000r/min離心2h。棄上層液體，沉淀用適量TEN重懸（渦旋或超聲波處理，使沉淀分散）。速度區(qū)帶離心農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第26頁密度梯度離心在離心管中加入不一樣濃度CsCl或蔗糖墊層，再加入病毒懸液，超高速離心。蔗糖密度梯度離心：在離心管中加入20%～60%不連續(xù)蔗糖密度梯度,0-25000r/min離心2h～3h，搜集蔗糖濃度為35%處病毒帶，加入適量緩沖液稀釋后，再次0-25000r/min離心2h，沉淀用適量TEN重懸。

PrV鄂A株電鏡觀察左圖：上帶中PrV粒子右圖：下帶中PrV粒子農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第27頁濃縮（方法二）將經(jīng)低速離心去掉細(xì)胞碎片及雜質(zhì)病毒懸液直接0-25000r/min離心2h。棄上層液體，沉淀用適量TEN重懸。將重懸病毒液再經(jīng)梯度離心純化。農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第28頁怎樣利用純化病毒進(jìn)行下一步研究研究病毒結(jié)構(gòu)研究病毒感染分子細(xì)節(jié)病毒粒子標(biāo)識(shí)研究與受體結(jié)合研究病毒侵入研究病毒在體內(nèi)移行農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第29頁病毒純化質(zhì)譜分析靶蛋白驗(yàn)證純化病毒是不是只含有病毒蛋白？農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之病毒純化第30頁