藥理實驗半數(shù)致死量專家講座

第九章半數(shù)致死量藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第1頁半數(shù)致死量基本概念寇氏法、目測概率單位法和序貫法等計算半數(shù)致死量方法半數(shù)致死量試驗設計方法。本章重點藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第2頁

在動物毒理學和藥理學研究中，通慣用試驗動物對某種藥品、毒物、細菌及理化刺激等反應來測定其效力或毒性。慣用指標是半數(shù)效量(medianeffectivedose:ED50)：指使半數(shù)試驗動物發(fā)生特定效應劑量，如半數(shù)治愈量、半數(shù)麻醉量、半數(shù)感染量、半數(shù)驚厥量、半數(shù)致死量等等第一節(jié)半數(shù)致死量概述藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第3頁第一節(jié)半數(shù)致死量概述死亡數(shù)劑量對數(shù)劑量累積死亡率對數(shù)劑量概率單位劑量累積死亡率藥品劑量與效應關系死亡數(shù)對數(shù)致死劑量藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第4頁第一節(jié)半數(shù)致死量概述半數(shù)致死量（medianlethaldose：LD50）：引發(fā)半數(shù)動物致死劑量安全性：治療指數(shù)＝LD50/ED50比值大安全性大安全范圍：當藥品治療效應與致死效應曲線不平行時，要看ED95和LD5距離，距離越大越安全。藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第5頁第一節(jié)半數(shù)致死量概述【測定LD50意義】

LD50反應藥品毒性大小。因為劑量與致死百分率曲線呈S形，因而LD50是劑量反應曲線上致死百分率改變最靈敏劑量點，重現(xiàn)性好，準確性高。藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第6頁第一節(jié)半數(shù)致死量概述

在進行藥品毒力試驗時，因為動物個體差異，藥品致死劑量經(jīng)常不一樣。對條件相同或相近動物用某種藥品逐步增加劑量當毒物劑量較小時，動物具耐受性，伴隨毒物劑量增加，動物開始死亡，這時毒物劑量為最小致死量（minimumlethaldose：mLD）。伴隨藥品劑量增加，動物死亡頭數(shù)也隨之增加，當藥品劑量增加到一定程度時動物全部死亡，這時毒物劑量稱為絕對致死量（LD100）。藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第7頁最小致死劑量和絕對致死量不適當性

在曲線兩端即藥品在低濃度或高濃度時藥品濃度改變對動物死亡率改變影響較小，動物死亡率對藥品濃度不敏感。在動物試驗中，不一樣批動物求得最小致死劑量和絕對致死量變動很大，以這種指標作為藥品毒力指標是不適當。第一節(jié)半數(shù)致死量概述藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第8頁第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法

半數(shù)致死量計算方法有各種，其中寇氏法最為慣用，目測概率單位法最為簡便，序貫法最節(jié)約試驗動物。下面將分別介紹這三種方法。一、寇氏法寇氏法是Kaeber（1931年）提出，又稱平均法它是依據(jù)對數(shù)劑量與致死百分數(shù)呈S形曲線，由S形曲線包含面積推導出致死百分率為50%相當劑量。藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第9頁第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法k為劑量組數(shù)xi+xi+1為相鄰兩組對數(shù)劑量之和Pi+1-pi為相鄰兩組致死百分率之差使用此公式條件是各組動物數(shù)相等，最小致死百分數(shù)為0%，最大致死百分數(shù)為100%1.計算藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第10頁第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法

當劑量呈等比數(shù)列或?qū)?shù)劑量呈等差數(shù)列，且最小和最大劑量組致死百分數(shù)分別為0%和100%時其中：—為最大對數(shù)劑量d—相鄰兩組對數(shù)劑量之差，即相鄰劑量比值對數(shù)假如p1不為0且小于20%，pk不等于1且大于80%時藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第11頁第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法2.求反對數(shù)得3.求標準誤

4.求95%置信區(qū)間藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第12頁【應用條件】

1劑量必須按等比級數(shù)（劑量對數(shù)按等級數(shù)）分組。2各組動物數(shù)應相等。3最小劑量組死亡率（Pn）應為0%，最大劑量組死亡率（Pm）應為100%；假如Pn<20%或Pm>80%需用校正公式計算；如Pn>20%或Pm<80%則不能用此法計算。第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第13頁【例】

為了研究銨碘消毒劑對建鯉毒力影響，隨機撈取210尾規(guī)格基本一致鯉魚，放入缸內(nèi)，每缸30尾，1組對照，6組處理。以等對數(shù)間距設置6個劑量水平（單位：）分別為：40.000、47.156、55.592、65.538、77.262、91.085，量取藥液并加入缸內(nèi)，攪拌均勻，96h后所得資料見下表。試求銨碘對建鯉半數(shù)致死量。第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第14頁組別劑量ml/m3動物數(shù)死亡數(shù)死亡率12345640.00047.15655.59265.53877.26291.08530303030303003152027300.0000.1000.5000.6670.9001.000第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第15頁本例中，相鄰劑量成等比級數(shù)，公比為0.8482，故對數(shù)劑量成等差級數(shù)。詳細計算步驟以下：（1）計算

=1.7688第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第16頁（2）求反對數(shù)得銨碘消毒劑對建鯉半數(shù)致死量為：（3）求標準誤=0.0577第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第17頁（4）求95%置信區(qū)間即銨碘消毒劑對建鯉95%置信區(qū)間為：第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第18頁第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法二、目測概率單位法

目測概率單位法是一個較為簡單計算方法，其基本原理是將劑量改變成對數(shù)劑量，再將死亡率（%）轉(zhuǎn)換成“概率單位”，則劑量反應曲線呈直線化，依據(jù)前述回歸分析畫出直線，再求出。藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第19頁第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法所謂概率單位（Probit）就是指標準正態(tài)曲線下面積相當于某一死亡率時橫軸上距離。為方便計算防止負號，標準正態(tài)變量u值一律加5，稱為概率單位（y），即：

將死亡率轉(zhuǎn)換為概率單位后，對數(shù)劑量與死亡率呈直線關系。據(jù)此便可用回歸法進行半數(shù)致死量預計。藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第20頁第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法【例】

為搞清氟對禽類毒性影響，選取1日齡羅曼褐蛋雞48羽，隨機分為6組，每組8羽，另設一組空白對照，經(jīng)飲水添加不一樣量氟化鈉，1次性灌喂，觀察7d天內(nèi)雛雞中毒死亡情況。計算指標。藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第21頁第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法濃度(mg/ml)雛雞數(shù)（n）死亡數(shù)（r）死亡率（%）80.608675.064.518562.555.628450.041.278337.533.038337.526.428225.0服氟化鈉水溶液后對雛雞毒性影響藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第22頁第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法1．編制計算表（1）將劑量換算成對數(shù)劑量x。（2）將死亡率換算成概率單位y。死亡率為0或100%者，它們對應概率單位是負無窮大和正無窮大，在直線化過程無意義，通常不計入計算，或用校正數(shù)，即0/0校正為0.25/n，100%校正為（n-0.25）/n，n為該組試驗動物數(shù)，本例不需校正。查附表16時：如死亡率為75%，其概率單位為5.674，余類推。藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第23頁第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法濃度(mg/ml)雛雞數(shù)（n）死亡數(shù)（r）死亡率（%）對數(shù)劑量（x）概率單位(y)80.608675.01.90655.67464.518562.51.80965.33255.628450.01.74525.00041.278337.51.61564.69533.038337.51.51894.69526.428225.01.42194.326服氟化鈉水溶液后對雛雞毒性影響藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第24頁第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法2.用回歸法求半數(shù)致死量。依表對數(shù)劑量（x）和概率單位(y)資料配置直線。先繪制“散點圖”，橫軸為對數(shù)劑量x，縱軸為概率單位y，繪制6個點，計算回歸方程，并作圖。本例中，回歸方程為藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第25頁第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法3.求半數(shù)致死量置信區(qū)間。上面求得是一個樣本指標，只能作為總體點值預計，一樣也可對總體作區(qū)間預計，即求總體置信區(qū)間。按公式求各致死劑量對數(shù)值標準差（s）。藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第26頁第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法本例取第一點（1.49,4.5），取第二點（1.88,5.5）代入公式得：依據(jù)下面公式求半數(shù)致死量對數(shù)值標準誤N′為概率單位4至6范圍內(nèi)（即死亡率為15.87%至84.13%范圍內(nèi)）各組試驗動物數(shù)。藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第27頁第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法本例，此范圍內(nèi)共用試驗動物數(shù)累計48頭，即N′

=48。故

進而半數(shù)致死量95%置信區(qū)間。

即34.19794(mg/ml)~70.14553(mg/ml)藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第28頁第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法

關于概率單位法慣用還有“概率單位法”和“加權概率單位法”（也叫“概率單位加權回歸法”），后者計算較為復雜，但常被看作最為有效方法?？紤]到計算復雜性，在多數(shù)統(tǒng)計軟件包中都有預計和程序，使用起來十分方便。藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第29頁三、序貫法序貫法是最能節(jié)約試驗動物一個方法，又稱“上下法”。因為其把計量集中用在50%反應率上下，所以在確定時含有很高效率。其普通方法是：依據(jù)以前經(jīng)驗選擇一個近50%反應率等比級數(shù)劑量組，通慣用4-6個劑量組，然后將動物一只一只有序地進行試驗，當動物出現(xiàn)陰性反應時，就選取較高一級劑量給予下一只動物，當出現(xiàn)陽性反應時，就選取較低一級劑量給予下一只動物，直到試驗結束，試驗所需動物總數(shù)n應在試驗開始前決定。第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第30頁【例】

為測定某試劑安全性，用序貫法測定此試劑小白鼠腹腔注射(mg/kg）,選取1月齡小白鼠22只，給藥對數(shù)劑量應盡可能從預計最可能靠近劑量開始，本例從1.85開始，死亡記為“+”號，存活記為“-”號。后一動物劑量上升或下降由前一動物死亡（S）或存活（F）來決定，從第一只改變算起（即表中第一條虛線起），至22只止，最終終止號（即第二條虛線后“×”）也作為一次試驗結果。其位置決定于末一只動物死亡或存活，末一只動物死亡者，下降一格給“×”，以存活論；末一只動物存活者上升一格繪“×”號，以死亡論。結果見表，其中S表示死亡，F(xiàn)表示存活。第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第31頁對數(shù)劑量（lgD）試驗動物號死亡存活累計12345678910111213141516171819

20212223S(+)F(－)r1.95+1011.90+－+2131.85++++－

+－+5271.80－－－+－+－+3581.75－－×033某藥品值測定結果計算公式為：第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第32頁=1.8295=67.5376mg/kg第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第33頁

序貫法簡便易行，適于反應快速藥品試驗，且使用動物較為節(jié)約，但不能預計誤差，無法進行顯著性檢驗，所以應用受到一定限制。但也有一些補充方法，可自行查閱相關資料。（比如，利用寇氏法中公式預計，將其中用本法代替，同時需計算本法中各劑量組死亡率。）第二節(jié)半數(shù)致死量測定方法藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第34頁

一、半數(shù)致死量試驗設計要求

1．試驗劑量確實定（１）劑量范圍選擇依據(jù)以往實踐經(jīng)驗，參考相關資料或進行預備試驗，了解動物全致死和全不致死劑量范圍。要求最小劑量等于0%死亡率劑量，最大劑量等于100%死亡率劑量。（２）劑量分組普通以5~8組為宜，要求死亡率在50%上下約各有二分之一組。如用寇氏法計算半數(shù)致死量，最好包含有死亡率為0%及100%計量組。第三節(jié)半數(shù)致死量試驗設計與應用藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第35頁

一、半數(shù)致死量試驗設計要求

1．試驗劑量確實定（３）各組劑量呈等比級數(shù)即換算成對數(shù)劑量后，其相鄰對數(shù)劑量呈等差級數(shù)。劑量比值可用下式計算。第三節(jié)半數(shù)致死量試驗設計與應用

求得比值以后，自第一劑量（最小劑量）開始乘以比值，即得相鄰下一組劑量，其余類推。相鄰兩組劑量比值=藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第36頁第三節(jié)半數(shù)致死量試驗設計與應用2．試驗動物選擇與分組（１）試驗動物選擇

除動物種屬選擇外，對動物個體年紀、體重、性別、生理狀態(tài)及健康情況等均應嚴格注意。在同一試驗中，動物年紀、體重應盡可能一致。動物毒性試驗普通應雌、雄動物分組同時進行。若是性別混合編組，則要求雌雄各半。藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第37頁第三節(jié)半數(shù)致死量試驗設計與應用

（２）設試驗組與對照組對試驗組給予一定量受試物質(zhì)以觀察毒物反應。試驗組與對照組除去處理原因（給受試物質(zhì)）不一樣外，其它條件應盡可能相同。在試驗時，假如對照組試驗動物出現(xiàn)死亡，普通應排除死亡原因，重作試驗。不過作昆蟲（如蚊子等）毒性試驗時，因小動物易發(fā)生自然死亡，當對照組試驗昆蟲死亡率在10%以下時，可對試驗組死亡率進行校正。然后依據(jù)校正死亡率計算半數(shù)致死量。校正死亡率=藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第38頁第三節(jié)半數(shù)致死量試驗設計與應用

3．操作規(guī)程與統(tǒng)計等都應有統(tǒng)一規(guī)格要求。在試驗過程中，應嚴格恪守試驗設計要求。尤其是分批試驗時，更應注意條件一致，人員操作一致，以防止產(chǎn)生無須要誤差。（３）試驗動物分組，必須嚴格恪守隨機化標準，以降低誤差。藥理實驗半數(shù)致死量專家講座第39頁第三節(jié)半數(shù)致死量試驗設計與應用二、半數(shù)致死量應用

1．毒力比與效力