分光光計的使用

分光光度計的使用當(dāng)前1頁，總共18頁。主要內(nèi)容１、分光光度法的概念２、分光光度計的結(jié)構(gòu)與原理３、分光光度計的使用４、實驗操作（CuSO4溶液標準曲線的繪制）當(dāng)前2頁，總共18頁。分光光度法的概念分光光度法：是利用物質(zhì)特有的吸收光譜，進行物質(zhì)鑒定及測定其含量的一種分析技術(shù)。也稱為吸收光譜法。是光譜分析技術(shù)中最常見的一種，應(yīng)用最多的是紫外及可見分光光度法。特點：靈敏、精確、快速和簡便。應(yīng)用：生物化學(xué)微量物質(zhì)定量分析測定研究中廣泛使用的方法之一，常用于糖，蛋白質(zhì)，核酸，酶等的快速定量檢測。光譜范圍：200～1000nm。當(dāng)前3頁，總共18頁。分光光度法的概念紅外分光光度計:大于760nm的紅外光區(qū)可見光分光光度計:400～760nm的可見光區(qū)紫外分光光度計:

200～400nm的紫外光區(qū)分光光度計的分類當(dāng)前4頁，總共18頁。722E可見分光光度計當(dāng)前5頁，總共18頁。722E可見分光光度計當(dāng)前6頁，總共18頁。分光光度計的基本結(jié)構(gòu)光源單色光器吸收池檢測系統(tǒng)鎢絲燈氫燈氘燈棱鏡衍射光柵玻璃比色杯石英比色杯硒光電池光電管光電倍增管當(dāng)前7頁，總共18頁。當(dāng)前8頁，總共18頁。當(dāng)一束單色光透過溶液時部分被吸收部分被反射部分被透過IrIaI入射光

I0出射光I比色皿吸收杯反射光

IrIa吸收光分光光度計基本原理當(dāng)前9頁，總共18頁。Ｉ/I0表示光線透過溶液的程度,稱為透光度,用T表示；－IgT表示溶液對光線的吸收程度，用吸光度（A）表示。即I0CIA＝－IgT＝－IgII0←L→

當(dāng)前10頁，總共18頁。Lambert-Beer定律（光吸收定律）Lambert定律：A＝K1LBeer定律：A＝K2C

Lambert-Beer定律：當(dāng)一束單色光垂直通過一均勻的溶液時，溶液的吸光度A，與溶液的濃度C及溶液的厚度L成正比。即A＝KCL其中：A－吸光度K－為消光常數(shù)，表示物質(zhì)對光線吸收的能力，受物質(zhì)種類和光線波長的影響C－溶液的濃度L－溶液的厚度當(dāng)前11頁，總共18頁。當(dāng)前12頁，總共18頁。Lambert-Beer定律的應(yīng)用1、利用標準管計算測定物的含量用一已知濃度標準溶液和一個未知濃度的待測溶液同樣處理顯色，測定吸光度，根據(jù)Lambert-Beer定律得：A1=K1C1L1A2=K2C2L2

因為K1=K2L1=L2

所以C2=A2A1×C1當(dāng)前13頁，總共18頁。Lambert-Beer定律的應(yīng)用2、利用標準曲線計算測定物含量先配制一系列已知濃度的測定物溶液，按要求方法處理顯色，在最大吸收波長（λmax）處讀取各管的吸光度，以各管吸光度A為縱坐標，對應(yīng)濃度C為橫坐標，作標準曲線。以后進行測定時，待測樣品以相同條件在λmax處讀取吸光度，從標準曲線上即可查得該待樣品的濃度。

當(dāng)前14頁，總共18頁。吸光度A蛋白質(zhì)濃度（μg/ml）蛋白質(zhì)標準曲線（雙縮脲法：λ＝540nm）0.20.40.6....40801201600當(dāng)前15頁，總共18頁。722E分光光度計使用基本操作：（示教）

通電→儀器自檢（BLA）→預(yù)熱20min→設(shè)定波長→方式設(shè)定（MOOD→T（或A）

→儀器調(diào)“0.000”(將遮光杯）置入光路，在T方式下按“%T”鍵，→儀器自動校正后顯示“0.000→參比液調(diào)“0.000”A

→樣品測定→讀取“A”。

當(dāng)前16頁，總共18頁。722E分光光度計使用注意事項：1、預(yù)熱----保證儀器準確穩(wěn)定；2、比色皿的清潔----待測液潤洗、沖洗；3、比色皿配套----比色皿不能隨意；4、比色皿內(nèi)盛液體量----2/3，有液體，應(yīng)用擦鏡紙拭干，以保證光路通過時不受影響；5、拿放比色皿----應(yīng)持其“毛面”，杜絕接觸光路通過的“光面”；6、溶液濃度要適當(dāng)：吸光度讀數(shù)處于0.1～0.7范圍內(nèi)為宜，否則誤差較大，要適當(dāng)調(diào)整濃度。7、分光光度計連續(xù)使用一般不超過2h。

當(dāng)前17頁，總共18頁。實驗操作實驗內(nèi)容：CuSO4溶液標準曲線的繪制操作步驟：1、用30%CuSO4溶液配制10%、15%、20%、25%、30%的CuS