動物細胞融合與單克隆抗體的制備(共38張)

知識回顧？？？？再分化？植物細胞雜交技術(shù)利用什么原理？用什么方法可以誘導(dǎo)植物細胞融合？一、原理：細胞膜具有流動性細胞的全能性二、誘導(dǎo)方法：電刺激、聚乙二醇植物細胞雜交技術(shù)有什么用途？三、用途：獲得雜種植株脫分化當(dāng)前1頁，總共38頁。動物細胞融合和單克隆抗體當(dāng)前2頁，總共38頁。一、動物細胞融合有些細胞的融合是正常的生命活動。如精子與卵細胞的結(jié)合。

兩個細胞正在融合

受精作用當(dāng)前3頁，總共38頁。(一)動物細胞融合的概念

動物細胞融合也稱細胞雜交,是指兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的過程。（二）動物細胞融合的過程與植物原生質(zhì)體融合原理相同，方法類似。雜交細胞:融合后形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞。當(dāng)前4頁，總共38頁。⑴.原理：1、動物細胞融合的基本原理是什么？2、動物細胞融合的誘導(dǎo)方式是什么？與植物細胞融合的誘導(dǎo)方式有什么不同？

與植物原生質(zhì)體融合的基本原理相同，即細胞膜的流動性。⑵.誘導(dǎo)方式：物理法：電激、振動、離心化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）生物法：滅活的病毒例如：仙臺病毒當(dāng)前5頁，總共38頁。仙臺病毒紫外線喪失感染性（不感染細胞）保留融合活性（誘導(dǎo)細胞融合）當(dāng)前6頁，總共38頁。細胞A細胞B雜交細胞滅活的病毒物理法化學(xué)法當(dāng)前7頁，總共38頁。滅活的病毒顆粒黏附于細胞表面細胞膜被病毒顆粒穿通細胞膜連接細胞融合，形成雜交細胞（細胞膜具有一定的流動性）當(dāng)前8頁，總共38頁。(三)動物細胞融合的應(yīng)用1.突破有性雜交方法的局限,使遠緣雜交成為可能。2.成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。鼠—雞、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—雞、人—蛙、酵母菌—雞、人—胡蘿卜等3、重要用途：制備單克隆抗體。當(dāng)前9頁，總共38頁。植物體細胞雜交、動物細胞融合的比較探究點一.細胞工程比較主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株意義物理、化學(xué)法（同左）滅活的病毒物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）誘導(dǎo)方法使細胞分散后誘導(dǎo)細胞融合去除細胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合細胞融合的方法細胞膜流動性細胞增殖細胞膜的流動性、植物細胞全能性原理動物細胞融合植物體細胞雜交比較項目克服遠緣雜交不親和性的障礙當(dāng)前10頁，總共38頁。思考與探究1.植物體細胞雜交技術(shù)與動物細胞融合技術(shù)有什么不同？植物體細胞雜交技術(shù)與動物細胞融合技術(shù)基本相同，不同的是植物體細胞融合前需去掉細胞壁，然后再融合；動物細胞融合是兩個體細胞直接融合。誘導(dǎo)融合方法不同：動物細胞誘導(dǎo)融合所用的方法比植物體細胞雜交多一類滅活的病毒誘導(dǎo)；結(jié)果不同：植物體細胞雜交培養(yǎng)成了雜種植株，而動物細胞融合只培養(yǎng)出了雜交細胞。當(dāng)前11頁，總共38頁。探究點二、單克隆抗體的制備

什么是抗體？

抗體是機體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。

當(dāng)前12頁，總共38頁。1、獲得抗體的傳統(tǒng)方法把某種抗原反復(fù)注射到動物體內(nèi)，然后從動物血清中分離出所需的抗體。缺點：產(chǎn)量低，純度低，特異性差。當(dāng)前13頁，總共38頁。三、單克隆抗體2、抗體是如何產(chǎn)生的？B淋巴細胞抗原增殖分化成漿細胞3、B淋巴細胞有何特點？一種B淋巴細胞能產(chǎn)生一種抗體。當(dāng)前14頁，總共38頁。思考：1、在體外培養(yǎng)的條件下，一個B淋巴細胞有沒有可能無限增殖？不可能2、我們學(xué)過的什么細胞具有這樣的能力？癌細胞3、有什么辦法讓B淋巴細胞也具有這樣的能力？細胞融合當(dāng)前15頁，總共38頁。人們發(fā)現(xiàn)，在動物發(fā)生免疫反應(yīng)的過程中，體內(nèi)的B淋巴細胞可以產(chǎn)生多達百萬種以上的特異性抗體，但是每一個B細胞只分泌一種特異性抗體。要想獲得大量的單一抗體，必須克隆單一的B淋巴細胞，形成細胞群。1、請從以上文字資料中找出單克隆抗體的概念用單個B淋巴細胞進行（無性繁殖）克隆，得到的基因型相同的細胞群能夠分泌一種化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體，這種抗體就叫做單克隆抗體。當(dāng)前16頁，總共38頁。一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體骨髓瘤細胞（癌細胞）能無限增殖雜種細胞動物細胞培養(yǎng)技術(shù)２、實驗原理：動物細胞融合創(chuàng)始人：米爾斯坦單克隆抗體既能產(chǎn)生特異性抗體，又能大量繁殖柯勒當(dāng)前17頁，總共38頁。如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？利用B淋巴細胞產(chǎn)生抗體的功能。利用腫瘤細胞無限增殖的特性。利用細胞融合的技術(shù)將兩種細胞融合獲得具有B淋巴細胞和腫瘤細胞特性的雜交瘤細胞。利用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細胞。當(dāng)前18頁，總共38頁。探究三：單克隆抗體的制備過程過程①免疫動物注射抗原的目的是什么？獲得能產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細胞（漿細胞）誘導(dǎo)細胞融合常用方法是什么？滅活的仙臺病毒如何進行篩選？具有篩選作用的培養(yǎng)基（HAT培養(yǎng)基）？種BB、B瘤、瘤瘤、雜交細胞如何獲得大量的單克隆抗體？②免疫B細胞和骨髓瘤細胞的制備③細胞融合④雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)⑤雜交瘤細胞的篩選⑥分泌單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立⑦單克隆抗體的大量制備當(dāng)前19頁，總共38頁。

？

？

抗原效應(yīng)B細胞篩選篩選（AA型、BB型）AB型雜交瘤細胞能產(chǎn)生所需抗體的細胞當(dāng)前20頁，總共38頁。過程：抗原小鼠效應(yīng)B細胞骨髓瘤細胞雜交瘤細胞細胞融合、篩選多孔培養(yǎng)板單個細胞培養(yǎng)，篩選能產(chǎn)生特定抗體的細胞群體外培養(yǎng)體內(nèi)培養(yǎng)提取出單克隆抗體當(dāng)前21頁，總共38頁?？伎寄?！1.在制備單克隆抗體的過程中，選用哪兩種細胞進行融合？為什么選擇這兩種細胞？漿細胞和骨髓瘤細胞漿細胞能產(chǎn)生單一抗體，但不能無限增殖；骨髓瘤細胞能無限增殖，但不能產(chǎn)生單一抗體。當(dāng)前22頁，總共38頁。考考你！2、在這過程中進行了幾次篩選？分別在哪個步驟進行篩選？兩次篩選。第一次在B細胞和骨髓瘤細胞融合以后篩選出雜交瘤細胞；第二次在雜交瘤細胞中篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細胞。當(dāng)前23頁，總共38頁。知識拓展如何進行雜交瘤細胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？融合后的細胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細胞就是雜交瘤細胞。但這些雜交瘤細胞并非都是能分泌所需抗體的細胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細胞稀釋，用多孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細胞還不能保證是來自單個細胞，挑選陽性孔的細胞繼續(xù)進行有限稀釋，一般需進行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細胞為單克隆細胞。該過程即為雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。當(dāng)前24頁，總共38頁。探究四、單克隆抗體的應(yīng)用

請同學(xué)們根據(jù)自己所收集的資料，談?wù)剢慰寺】贵w的應(yīng)用。１可用于作為診斷試劑：有準(zhǔn)確，高效，快速的優(yōu)點２可用于疾病治療３可用于運載藥物（作為運載對應(yīng)疾病的藥物的“生物導(dǎo)彈“。）“生物導(dǎo)彈”＝單克隆抗體＋藥物當(dāng)前25頁，總共38頁。小結(jié)當(dāng)前26頁，總共38頁。

細胞骨髓瘤細胞細胞融合

漿篩選

瘤細胞

雜交細胞培養(yǎng)選出能產(chǎn)生特定抗體的細胞群繼續(xù)培養(yǎng)體外培養(yǎng)

體內(nèi)培養(yǎng)從培養(yǎng)液或小鼠腹水中取出

單克隆抗體當(dāng)前27頁，總共38頁。練習(xí)：1、動物細胞融合和植物原生質(zhì)體融合比較，在動物細胞融合中有特殊性的是（）A、融合的原理B、融合的優(yōu)點C、融合的誘導(dǎo)手段D、融合的過程當(dāng)前28頁，總共38頁。練習(xí)：2、動物細胞融合的目的中最重要的是（）A、克服遠緣雜交不親和B、制備單克隆抗體C、培育新物種D、生產(chǎn)雜種細胞當(dāng)前29頁，總共38頁。練習(xí)：3、科學(xué)家用小鼠骨髓瘤細胞與某種細胞融合，得到雜交細胞，經(jīng)培養(yǎng)可產(chǎn)生大量的單克隆抗體，與骨髓瘤細胞融合的是（）

A、經(jīng)過免疫的B淋巴細胞

B、不經(jīng)過免疫的T淋巴細胞

C、經(jīng)過免疫的T淋巴細胞

D、不經(jīng)過免疫的B淋巴細胞當(dāng)前30頁，總共38頁。練習(xí)：4.單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細胞和B淋巴細胞誘導(dǎo)融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細胞是（）①淋巴細胞②小鼠骨髓瘤細胞③B淋巴細胞自身融合細胞④小鼠骨髓瘤細胞自身融合細胞⑤雜交瘤細胞

A．②④B．①③⑤

C．①②③④D．②③當(dāng)前31頁，總共38頁。練習(xí)：5、研究單克隆抗體治療癌癥的思路是（）A．利用單克隆抗體特異性地對抗癌細胞B．以單克隆抗體作抗癌藥物殺死癌細胞C．抗癌物質(zhì)在克隆細胞中大量合成D．單克隆抗體攜帶抗癌藥物特異性地與癌細胞結(jié)合當(dāng)前32頁，總共38頁。練習(xí)：6．只能使動物細胞融合的常用誘導(dǎo)方法（）

A．PEG

B．滅活的病毒

C．電刺激D．離心7、“生物導(dǎo)彈”是指（）

A.單克隆抗體B.雜交瘤細胞

C.產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞

D.在單抗上連接抗癌藥物當(dāng)前33頁，總共38頁。練習(xí)：8、下列關(guān)于單克隆抗體的制備和應(yīng)用的敘述中，不正確的是（）A．B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的融合，一般不

需要滅活的仙臺病毒或聚乙二醇誘導(dǎo)B．融合后形成的雜交瘤細胞既能無限增殖，又

能產(chǎn)生單克隆抗體C．體外培養(yǎng)時，一個效應(yīng)B淋巴細胞可以產(chǎn)生

抗體，但不能無限增殖D．單克隆抗體與常規(guī)抗體相比，特異性強，靈

敏度高，優(yōu)越性明顯A當(dāng)前34頁，總共38頁。在多孔培養(yǎng)板上，在每孔只有一個雜交瘤細胞的情況下，培養(yǎng)得到的細胞群是單個雜交瘤細胞克隆得來的，所以產(chǎn)生的抗體必然是化學(xué)性質(zhì)單一的，特異性強的單克隆抗體。這里的單克隆確有單個細胞克隆的含義，只不過克隆的不是B淋巴細胞，而是雜交瘤細胞。雜交瘤細胞既能迅速大量繁殖，又能產(chǎn)生專一抗體。當(dāng)前35頁，總共38頁。2.制備單克隆抗體時，為什么要選用B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞？哺乳動物感染抗原后，其體內(nèi)會形成相應(yīng)的B淋巴細胞，B淋巴細胞能分泌相應(yīng)的抗體凝聚或殺死這些抗原。動物在免疫反應(yīng)的過程中，每一種B淋巴細胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細胞大量增殖。B淋巴細胞具有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖；骨髓瘤細胞是一種癌細胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。因此，把一種B淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細胞，它會兼有兩個親本細胞的特性──在體外培養(yǎng)條件下能不斷增殖，同時能產(chǎn)生出某種特異性的抗體。當(dāng)前36頁，總共38頁。知識拓展3.為什么不只用兩個而要用多個細胞進行動物細胞間的融合？就目前常用的細胞融合方法來看，不管是用物理的、化學(xué)的方法，還是生物的方法，其融合率都不可能是100%。僅用兩個細胞融合，其效率太低，不一定能得到融合細胞。更重要