怎樣選擇色譜柱

如何選擇色譜柱現(xiàn)代高效液相色譜中，分別成效利害很大程度上取決于色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬，要做適合的選擇，一定對此有必定的認識和認識。1、正相色譜正相色譜用的固定相往常為硅膠（Silica），以及其余擁有極性官能團，如胺基團(NH2,APS)和氰基團（CN，CPS）的鍵合相填料。因為硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其余團的極性較強，所以，分別的序次是依照樣品中的各組份的極性大小，即極性強弱的組份最初被沖刷優(yōu)秀譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對照固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿Chloroform）,二氯甲烷（MethyleneChloride）等。2、反相色譜反相色譜填料常是以硅膠為基礎(chǔ)，表面鍵合有極性相對較弱的官能團的鍵合相。反相色譜所使用的流動相極性較強，往常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混淆物。樣品流優(yōu)秀譜柱的次序是極性較強組合最初被沖出，而極性弱的組份會在色譜柱上有更強的保存。常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。二、聚合物填料聚合物調(diào)料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要長處是在PH值為1～均可使用。相對與硅膠基質(zhì)的C18填料，這種填料擁有更強的疏水性；大孔的聚合物填料對蛋白質(zhì)等樣品的分別特別有效。此刻的聚合物填料的弊端是相對硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。三、其余無機填料其余HPLC的無機填料色譜柱也已經(jīng)商品化。因為其特別的性質(zhì)，一般僅限于特別的用途。如石墨化碳也用于正漸漸成為反相色譜填料。這種填料的分別不一樣與硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保存的基礎(chǔ)，不再需其余的表面改性，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保存能力更強，石墨化碳可用于分別某些幾何導(dǎo)構(gòu)體，又由于HPLC流動相中不會被溶解，這種柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可用于HPLC，氧化鋁微粒剛性強，可制成穩(wěn)固的色譜柱柱床，其長處是可在PH高達12的流動相中使用。但因為氧化鋁與堿性化合物作用也很強，應(yīng)用范圍遇到必定的限制，所以未能寬泛應(yīng)用，新式氧化鋯填料也可用于HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)PH范圍1～14，溫度可達100℃。因為氧化鋯填料幾年才開始研究，加之面對的實驗難度，其重要用途與優(yōu)勢尚在進行中。如何選擇填料粒度當(dāng)前，商品化的色譜料粒度從1um到超出30um均有銷售，而當(dāng)前剖析分別主要用3um、5um和10um填料，填料的粒度主要影響填補柱的兩個參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3um的填料應(yīng)用，在同樣選擇性條件下，提升柱效可提高分別度，但不是獨一的要素。假如固定相選擇是正確，可是分別度不夠，那么選擇更小粒度的填料是很實用的，3um填料填補柱的柱數(shù)比同樣條件下的5um填料的柱效提升近30%；但是，3um的色相譜的背壓倒是5um的2倍。與此同時，柱效提升意味著在同樣條件下能夠選擇更短的色譜柱，以縮短剖析時間，此外，能夠采納低粘度的溶劑做流動相或增添色譜柱的使用溫度，比方用乙腈取代甲醇，以降低色譜柱的壓力。一、如何保證優(yōu)秀的柱性能與柱壽命◆認證閱讀色譜柱使用說明書；◆使用填補優(yōu)秀的色譜柱；◆盡量減少壓力顛簸，防止機械及熱沖擊；◆使用保護柱及在線過濾器；◆常常以強溶劑沖刷色譜柱；◆充分過濾樣品及流動相，盡量防止雜質(zhì)微粒與強保存成分；◆用穩(wěn)固的固定相（C18最穩(wěn)固）；◆在中等PH值操作（6~8），用有機緩沖溶液；◆色譜柱使用溫度最好小于40℃；◆硅膠基質(zhì)的的色譜柱，應(yīng)保持流動相的PH值范圍在3.0~8.0；◆在水流動相與緩沖溶液中加200ppm的疊氮鈉；◆流動相中含有緩沖溶液，應(yīng)注意應(yīng)95∶5的水及有機溶劑過渡，有機溶劑不可以低于5%；◆留宿或儲存時，沖刷掉鹽緩和沖液，用純有機溶劑流動相保存（乙晴最好）。HPLC名稱Silica

固定相及應(yīng)用范圍又名功能基團

-OH

正相

反相

離子對√

應(yīng)用

非極性和中等極性以及非離子性有機化合物。SASC1-(CH3)3√在全部的烷基鍵合相中對非極性化合物保存最弱，典型用于中等極性和多官能團化合物.ButylC4-C4H9√√分別肽和蛋白質(zhì)，保存時間比C8和C18短。MOSC8，-C8H17√√中等極性相中對中等化合物，小肽和蛋白質(zhì)，Octyl極性藥族化合物和環(huán)境樣品。ODSC18-CH37√√烷基鍵合相中對中等極性18化合物保存最強。廣泛用于藥物，甾族化合物，脂肪酸和環(huán)境樣品.CPSCN,Cyano-(CH)CN√√對極性化合物有獨到的選擇性，適23合應(yīng)用于正相(propyl分別，當(dāng)用于反相系統(tǒng)時，其選擇性與C8和Nitrile)C18不一樣，在藥學(xué)領(lǐng)域和復(fù)雜混淆物的分別中應(yīng)APS

NH2

-(CH2)3NH2

√

√

用寬泛。反相中剖析糖類和其余極性化合物。弱陰離子交(AminoPropyl)

換，陰離子和有機酸則應(yīng)用緩沖劑和有機改性劑做流動相。正相中與硅膠的選擇性機改性劑不一樣,剖析芬芳族成效很好。PhenylDiol

-(CH3)C6H5-(CH2)2O

√√芬芳族化合物√√反相時，分別肽和蛋白質(zhì)。正相時，與硅選擇SCXSAX

強陽離子互換強陰離子互換

CH2(CH2OH)2-(CH2)2C6H4SO3H--(CH2)3N+(CH3)3

性相像,但極性較弱。√有機堿有機酸，核苷和核苷酸二、如何解決色譜柱使用過程中出現(xiàn)的問題1.保存值與分別度重現(xiàn)性不好原由剖析問題

原由

表現(xiàn)不一樣色譜柱間差別

填料、鍵合相不一樣

保存因子（

k），分別因子（α）使用時期柱變化

柱床損壞

柱效（N）鍵合相丟掉

保存因子（k），分別子（α）硅膠基質(zhì)溶解

柱效（N）強保存分聚積擁塞

保存因子（

k），柱效（

N）柱外效應(yīng)

系統(tǒng)差別，進樣量大、柱效（N）進樣閥與色譜柱之間、色譜柱與檢測器之間管路太長、檢測器流通池體積大、接頭死體積大等。分別成效變差

流動相組分改變

保存因子（

k），柱效變化很小流速改變

保存因子（

k），分別因子（α）溫度改變

保存因子（

k），柱效變化很小柱均衡慢柱超載

從頭均衡時間不夠樣品量太大

保存因子（k），柱效變化很小保存因子（k），柱效（N）造成色譜峰（不對稱）拖尾的原由1.色譜柱自己填裝問題，篩板擁塞或填料塌陷；2.柱頭有污染；樣品超載；樣品溶劑不適合；5.柱外效應(yīng)；化學(xué)或二次保存（硅羥基）效應(yīng)；緩沖容量不足或不適合；重金屬污染。3.如何解決峰形拖尾的問題A．與化學(xué)有關(guān)的拖尾問題1．流動相中，加入30mM的三乙胺（用與堿性化合物）或醋酸胺（用與酸性化合物），未知化合物加醋酸三乙胺；2．如仍舊拖尾，將三乙胺換為二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；3．降低進樣量至<1ug。B．與色譜柱有關(guān)的拖尾問題1．如柱頭處有強保存的樣品組分聚集，反相柱可用20倍柱體積的96%的二碌甲烷與4%甲醇，加1%氫氧化銨混淆液沖刷，正向柱可用甲醇沖刷。2．使用保護柱C．與HPLC系統(tǒng)有關(guān)的峰拖尾和峰加寬1．進樣體積過大，（往?！?5uL）；2．進樣閥與色譜柱及檢測器之間的管路體積過大（最正確連結(jié)收應(yīng)<20cm，內(nèi)徑0.007″）；3．檢測器流通池的體積過大。4．如何儲藏色譜柱1．防備緩沖溶液和水溶液流動相產(chǎn)生微生物，做到流動相用多少配多少，或在水流動相中加200ppm的疊氮鈉以克制細菌成長（必定小心其毒性和潛伏的爆炸性）；或在流動相中加20%的有機改性劑，也可克制微生物生長，有機改性劑還有助于流動相脫氣。2．盡可能將色譜柱儲存于100%有機溶劑（乙晴最好）中，防止在緩沖溶液中保存。3．使用緩沖溶液后的色譜柱，應(yīng)用15～20倍柱體積的不含緩沖劑的同種水—有機溶劑流動相沖刷色譜柱，后換成100%有機溶劑儲藏。4．防止用純凈水沖刷鍵合致密的C18柱。5．將色譜柱的兩頭用堵頭擰好，免得柱床填料干裂。如何選擇保護柱如何選擇保護柱，但又不可以影響分別剖析？這是色譜工作者常常提出的一個問題。往常，在選擇保護柱以前第一要考慮的是樣品能否潔凈。關(guān)于大多半剖析工作者來說，一只1cm長的保護柱，那么就應(yīng)選擇2cm或3cm長的保護柱。保護柱越長，自然所裝填的色譜填料就越多，則其越能防止污染物進入剖析色譜柱的時機。自然，跟著保護柱的長度加長，樣品的保存時間會比使用短保護柱長。一般來說，保護柱的內(nèi)徑與剖析色譜柱的內(nèi)徑同樣或相立即可。保護柱的填料裝填方式也很重要。當(dāng)前有薄膜裝填法的保護柱，使用過程很簡單方便，并且能夠在實驗室中進行干裝?？墒牵渥畲蟮谋锥耸遣唤?jīng)濟，特別是針對中國的詳細狀況，一次性使用相對花費較高。此外，薄膜裝填法的保護柱所裝填的色譜填料有限，只好供給有限的保護作用；可是也因為所裝填的色譜料較少，保護柱的長度也較短，所以對剖析樣品的保存時間的影響也很小。另一種保護柱構(gòu)造其實質(zhì)是縮短了的色譜剖析拄，設(shè)計方式上有直連式、手緊式或整體式。整體式設(shè)計是由色譜的生產(chǎn)廠商直接安裝在色譜剖析柱上的，一定與色譜剖析柱一起訂貨，能夠特別方便地使用，但不可以夠被改正。直連式構(gòu)造設(shè)計可在任何時候有色譜工作者來安裝連結(jié)，能夠與任何品牌的色譜剖析柱連結(jié)使用，并且還能夠依據(jù)樣品的有關(guān)狀